未変性タンパク質の免疫沈降

このプロトコールは、Protein A Agarose Beadsで未変性タンパク質を免疫沈降し、ウェスタンブロッティングまたはキナーゼ活性による解析を行う場合にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808) 1X PBSを1 L用意する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。

2. 10X Cell Lysis Buffer：(#9803) To prepare 10 ml of 1X cell lysis buffer, add 1 ml cell lysis buffer to 9 ml dH₂O, mix.

   注意：使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください。

3. 3X SDSサンプルバッファー：Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)。1/10容量の30X DTTを3X SDSローディングバッファーに加え、還元作用を持つ新しい3X ローディングバッファーを調製してください。
4. Protein A Agarose Beads: (#9863)
5. 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用)：(#9802) 1X Kinase Bufferを1 mL用意する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH₂O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
6. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用)：(#9804) ATP (200 µM) 0.5 mLを用意する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490 µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗ってください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
5. 氷上で超音波処理を3回 (各5秒間) 行なってください。
6. 4°C、14,000​ x gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (オプション)

1. ビーズのストックをボルテックスして混ぜ合わせてください。
2. 50%のProtein A Agarose Beadsスラリー 10–30 µLを、1 mg/mLの細胞ライセート200 µLに加えてください。
3. ローテーターを用いて、4°Cで30-60分間インキュベートしてください。
4. 4°Cで10分間遠心分離してください。上清を新しいチューブに移してください。
5. 次の免疫沈降へと進んでください。

免疫沈降

重要：一次抗体の免疫沈降で特異的な結合を確認するために、適切なアイソタイプコントロールの使用を強くお勧めします。ラビットポリクローナル一次抗体にはNormal Rabbit IgG＃2729、ラビットモノクローナル一次抗体にはRabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control＃3900、マウスモノクローナルIgG1一次抗体にはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control＃5415、マウスモノクローナルIgG2a一次抗体にはMouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656、マウスモノクローナルIgG2b一次抗体にはMouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484、Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988を使用してください。同一濃度のアイソタイプコントロールを用い、また、一次抗体のサンプルと並行してプロトコールを進める必要があります。

1. 製品データシートに記載されている推奨希釈率に従い、一次抗体を、1 mg/mLの細胞ライセート 200 µLに加えてください。ローテーターを用いて、4℃で一晩インキュベートしてください。
2. Protein A Agarose Beads (50% ビーズスラリー) を10–30 µL加えてください。ローテーターを用いて、4°Cで1–3時間インキュベートしてください。
3. 4°Cで30秒間遠心分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼ活性分析 (セクション D) で解析してください。

D. サンプルの解析

以下のステップから適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

1. 3X SDS Sample Buffer 20 µLにペレットを再懸濁してください。ボルテックスした後、14,000 x gで30秒間、遠心分離してください。
2. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
3. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。
4. サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。

注意：When using primary antibodies produced in rabbit to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) or Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured rabbit heavy chain. For proteins with a molecular weight in the range of 25 kDa, Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) is recommended to minimize interference produced by denatured mouse light chain.

When using primary antibodies produced in mouse to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured mouse heavy chain.

キナーゼアッセイで解析する場合

1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
4. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲル (4–20%) にロードしてください。