磁気分離を利用した免疫沈降プロトコール (ウェスタンブロッティングによる解析)

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808)
2. 1X Cell Lysis Buffer： (#9803) 1X Cell Lysis Bufferを10 mL用意する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH₂O) 9 mLに加え、混ぜ合わせてください。

   注意：使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください。

3. Protein AまたはProtein G磁気ビーズ： Rabbit IgGの免疫沈降にはProtein A (#73778) を、Mouse IgGの免疫沈降にはProtein G (#70024) を使用してください。
4. 3X SDS sample buffer： Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)。1/10容量の30X DTTを3X SDSローディングバッファーに加え、還元作用を持つ新しい3X ローディングバッファーを調製してください。
5. 磁気分離ラック：(#7017) あるいは (#14654)

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を回収する場合、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回洗ってください。
3. PBSを除去し、氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを各プレート (10 cm) に加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
5. 氷上でサンプルを各5秒間、3回超音波処理してください。
6. 14,000 x g、4°Cで10分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移してください。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (推奨ステップ)

Protein AまたはG磁気ビーズへの非特異的なタンパク質の吸着を低減させるために、細胞ライセートのプレクリアステップを強くお勧めします。テストサンプルとアイソタイプコントロールを用意するのに十分な量のライセートをプレクリア処理してください。

1. 磁気ビーズのストックチューブを手早くボルテックスし、再懸濁してください。

   重要：使用直前に、Magnetic Beads (#73778あるいは#70024​) を前洗浄してください：

2. ビーズスラリー20 μLを新しいチューブに移してください。チューブを磁気分離ラックに10-15 秒間設置してください。

   溶液が澄んだらバッファーを注意深く除去してください。1X Cell Lysis Buffer 500 μLを磁気ビーズペレットに加え、手早くボルテックスしてビーズを洗ってください。チューブを磁気分離ラックに戻してください。溶液が澄んだらバッファーを除去してください。もう一度、洗いの操作を繰り返してください。

3. 細胞ライセート200 μLを前洗浄した磁気ビーズ20 μLに加えてください。

   重要：ライセートの至適濃度は、標的タンパク質の発現レベルによって異なります。開始濃度として、250 μg/mL-1.0 mg/mLをお勧めします。

4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
5. 磁気分離ラックを使用して、ビーズをライセートから分離し、プレクリアされたライセートを新しいチューブに移して、磁気ビーズペレットを捨ててください。
6. 免疫沈降セクションへと進んでください。

免疫沈降

重要：一次抗体の免疫沈降で特異的な結合を確認するために、適切なアイソタイプコントロールの使用を強くお勧めします。ラビットポリクローナル一次抗体にはNormal Rabbit IgG＃2729、ラビットモノクローナル一次抗体にはRabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control＃3900、マウスモノクローナルIgG1一次抗体にはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control＃5415、マウスモノクローナルIgG2a一次抗体にはMouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656、マウスモノクローナルIgG2b一次抗体にはMouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484、Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988を使用してください。同一濃度のアイソタイプコントロールを用い、また、一次抗体のサンプルと並行してプロトコールを進める必要があります。

1. 一次抗体を製品データシートに推奨されている適切な希釈率になるように、細胞ライセート200 μLに加えてください。ローテーターを用いて、4°Cで一晩インキュベートし、免疫複合体を形成させてください。
2. 予め磁気ビーズを前洗浄してください (細胞ライセートのプレクリアセクション、ステップ1と2を参照してください)。
3. ライセートと抗体 (免疫複合体) を含む溶液を、前洗浄した磁気ビーズぺレットを入れたチューブに移してください。
4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
5. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
6. ペレットを3X SDSサンプルバッファー20-40 μLで再懸濁し、手早くボルテックスして混ぜ合わせ、手早く遠心分離してサンプルを沈殿させてください。
7. サンプルを95-100°Cで5分間加熱してください。
8. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。上清を新しいチューブに移してください。上清がサンプルです。
9. サンプル (15-35 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
10. ウェスタンブロットでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください：Western BSAまたはWestern 脱脂粉乳 )。

注意：分子量が50 kDaのタンパク質の検出では、変性した重鎖によるマスキングを最小化するために、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) を二次抗体として使用することをお勧めします。分子量が25 kDa付近のタンパク質には、変性した軽鎖による干渉を最小化するために、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127) をお勧めします。