免疫蛍光染色 (IF) のトラブルシューティングガイド

サンプルの保管が不適切。蛍光色素が長時間光にさらされると、シグナルが減衰することがある

サンプルのインキュベートと保存は、暗所で行ってください。ProLong® Gold Antifade Reagent #9071などの褪色防止剤でサンプルを封入することを推奨します。サンプルは封入後、すぐに観察してください。

固定が不適切

推奨プロトコールを製品のデータシートで確認してください。薬剤などで処理した後は、培地を除去し、固定液中で素早くかつ十分に固定してください。リン酸化特異的抗体については、4%以上のホルムアルデヒドを用いて内因性ホスファターゼの活性を阻害してください。

推奨されたインキュベート時間を用いていない

一次抗体のインキュベートについて十分に検証されたプロトコールを用いることで、一貫性と信頼性のある結果が得られます。CSTの抗体は、4°Cで一晩インキュベートすることで最良の結果が得られるように開発され、検証されています。

標的タンパク質の発現が適切に誘導されていない

標的タンパク質ごとに、最適な処理条件とコントロールを決定してください。

透過化の方法が不適切

推奨プロトコールを製品データシートで確認してください。

励起波長が不適切

光源と検出方法 (レーザー/励起/吸収フィルター) が、蛍光色素の励起波長と一致することを確認してください。

サンプルの自家蛍光

染色していないサンプルをコントロールとして用いて、自家蛍光のレベルを確認してください。推奨された固定液を製品データシートで確認してください。古くなった固定液では自家蛍光が高くなる可能性があります。ホルムアルデヒド溶液が古い場合は、新たに調製してください。アンプルから新たに希釈したEMグレードのグルタルアルデヒドを使用してください。発現量の低い標的に対しては、波長のより長いチャネルを選択してください。

抗体の希釈率が不適切 (一次抗体あるいは二次抗体の濃度が高すぎる)

推奨希釈率を製品データシートあるいは製品ウェブページで確認してください。

洗浄が不十分

洗浄によって、過剰な固定液、過剰な二次抗体、弱く非特異的に結合している抗体を取り除いてください。

非特異的な抗体結合

可能なら、ノックダウン (siRNA) あるいはノックアウト細胞と比較するか、標的となる抗原の発現が高いあるいは低いことが知られている細胞と比較してください。