SignalStar^™ Multiplex IHCのよくある質問

質問

• SignalStar Multiplex IHCキットと試薬はどのように検証されていますか？
• このアッセイは凍結した組織で機能しますか？
• 使用可能な抗ヒト抗体はありますか？
• 使用可能な抗マウス抗体はありますか？
• 使用可能な抗体のリストに目的のバイオマーカーが見当たりません。他の抗体をパネルに追加することができますか？
• このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？
• SignalStar染色と発色染色を連続切片を用いて比較すると、SignalStar染色ではより多くの陽性細胞が見えます。この過剰な染色が正しいどうかを、どのように確認すれば良いですか？
• 染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？
• SignalStarキットと試薬を、使用を予定している組織で最適化する必要がありますか？
• このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？
• このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？
• 脂肪組織や厚い脳組織切片、または正常な腎臓組織などの自家蛍光が高い組織でこのアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

回答

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーで選択可能な各抗体を入念に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、従来の発色アッセイでも用いられるこれらの抗体は、この蛍光アッセイの基礎となるため、厳密に試験されています。すべてのマルチプレックス構成や組織を試験することはできません。その他のご質問については、テクニカルサポートページをご覧ください。

このアッセイは凍結した組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、凍結された組織での使用についてはまだ検証されていません。現在、新鮮組織または凍結組織で使用するための抗体とプロトコールを検証中です。

使用可能な抗ヒト抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで「Human」を選択すると、使用可能な抗ヒト抗体のリストが表示されます。

使用可能な抗マウス抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで「Mouse」を選択すると、使用可能な抗マウス抗体のリストが表示されます。

使用可能な抗体のリストに目的のバイオマーカーが見当たりません。他の抗体をパネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、リストに含まれない抗体の使用に対しては検証されていません。現在、SignalStarアッセイでお手持ちの抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

SignalStar mIHCは、サンプルを破壊しない技術です。したがって、SignalStarアッセイ後に同じ組織で、目的の抗体を使用した直接免疫蛍光染色を行うことができます。また、SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使用することにより、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、直接免疫蛍光染色で標的を可視化できます。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、直接標識抗体と組み合わせての使用について検証されています。また、SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使用することにより、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、直接免疫蛍光染色で標的を可視化できます。この方法で、強力な細胞表面マーカーに対する多くの直接標識抗体が機能することが分かっています。詳細は、弊社の最新のポスターをご覧ください。さらに、直接免疫蛍光染色イメージングに使用可能な、弊社の直接標識抗体の製品ラインをご覧ください。

SignalStar染色と発色染色を連続切片を用いて比較すると、SignalStar染色ではより多くの陽性細胞が見えます。この過剰な染色が正しいどうかを、どのように確認すれば良いですか？

最適化の過程で、蛍光染色は発色染色よりも高い陽性率を示す可能性があることが分かりました。過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色と共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8陽性細胞がCD3陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

1回目のイメージングラウンドでは、染色完了後、最大8時間後までは強いシグナルを示すと考えられます。2回目のイメージングラウンドでは、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最大8時間後までは強いシグナルを示すと考えられます。

SignalStarキットと試薬を、使用を予定している組織で最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、抗体と蛍光色素の組み合わせや抗体の染色順について最適化されています。バイオマーカーの特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどの調整により、実験で最適なシグナルを得ることができます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？

発色IHCにおいて、各マーカーが陽性であることが既知のあらゆる組織が、ポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを用いてください。

このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？

最適な結果を得るためには、SignalStarのプロトコールから逸脱することは推奨しません。しかし、プロトコールに詳述されている抗原賦活化方法を使えない場合は、蛍光シグナルは低下しますが、電子レンジを使用してみても良いかもしれません。存在量が低いマーカーを検出する場合は、電子レンジの使用は推奨しません。この代替法の場合は、結果の保証はできません。

電子レンジを使用した抗原賦活化方法：

1. 250 mLの1X EDTA賦活化溶液を調製する場合は、25 mLのSignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747を225 mLのdH₂Oで希釈してください。
2. スライドを耐熱容器に入れた1X EDTA賦活化溶液に浸し、沸騰するまで電子レンジで加熱します (出力レベル10で約2.5分間)。
3. 沸騰直前の温度 (95 - 98°C) で15分間加熱します。ほとんどの電子レンジでは、パワーレベル3で8分間、パワーレベル2で7分間になります。
4. スライドが入った容器を電子レンジから取り出して、dH₂Oの蛇口の下に置きます。すべてのEDTAがdH₂Oに置換されるまで、スライド容器に直接水を5分間加えます。その後の冷却は必要ありません。

脂肪組織や厚い脳組織切片、または正常な腎臓組織などの自家蛍光が高い組織でこのアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

弊社は、最適化の過程で様々な腫瘍や組織タイプを使用していますが、すべての組織や発現レベルを確認することはできません。推奨プロトコールに従えば、このアッセイはFFPE組織 (厚さ4 - 5 μM) でも機能するはずです。また、このアッセイでは、高い増幅機能により強力かつ特異的なシグナルが得られるため、自家蛍光が非常に高いレベルの組織であっても解析できる可能性があります。

テクニカルサポート

SignalStarに関するトラブルシューティング情報や技術的な質問に対する回答は、テクニカルサポートページをご覧ください。

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U.S. Patent No. 10,781,477, foreign equivalents, and child patents deriving therefrom.