Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581のアッセイプロトコール

次の製品の専用プロトコールです： Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) Activity Assay Kit #12581.

A.機器

1. 励起波長、蛍光波長それぞれ約530 nm、590 nmの測定ができる96-ウェルプレートリーダー
2. 96-ウェル黒色プレート

B. 試薬の調製

1. キットに含まれる以下の凍結乾燥品を溶解してください。

   成分	精製水 (dH2O) の量
   G6PDH substrate	250 μL
   G6PDH Developer	100 μL
   G6PDH positive control	50 μL
   NADP	100 μL
   G6PDH cofactor	100 μL

2. 試験数を計算してください：サンプルの数+陽性コントロール。
3. 表1-2をもとに、計算された試験数に応じて必要量のTotal Detection Solutionを調製してください。
   • 96-ウェルプレートには、70 μL/ウェルが推奨されています
   • 384-ウェルプレートには、20 μL/ウェルが推奨されています

例：試験回数＝10サンプル (n=3) +3陽性コントロール

• 96-ウェルプレート：70 μL/ウェル x 33サンプル=2310 μL+10% =～2500 μL
• 384-ウェルプレート：20 μL/ウェル x 33サンプル=660 μL+10% =～750 μL
4. 表1-2をもとに、ネガティブコントロール溶液を調製してください。

注意：G6PD基質を陰性コントロール溶液に加えないでください

5. 表1-2をもとに、ポジティブコントロール溶液を調製してください。
6. 1X Cell lysis bufferを調製してください。

表1：96-ウェルプレートを使用した場合の10サンプル計算例 (triplicate実験)

表2：384-ウェルプレートを使用した場合の10サンプル計算例 (triplicate実験)

C. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 解析対象となる細胞を80-90%コンフルエンスまで増殖させ、培地を吸引除去してください。
2. 実験目的に応じて、調節因子等を含む新しい培地を加え、細胞に適切な時間、適切な処理を行なってください。
3. 培地を吸引除去し、細胞を氷冷した1X PBS (#9872) で1回洗浄してください。
4. PBSを吸引除去し、氷冷した1X Cell Lysis Buffer (1 mM PMSF添加) を各プレート (直径10 cm) 当たり0.5 mL加えてください。
5. 氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
6. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
7. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
8. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。
9. アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 解析対象となる細胞を増殖させ、生細胞密度が0.5​-1.0 x 10⁶細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (~1200 rpm) により細胞を回収し、5​-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
3. 1X Cell Lysis Buffer (1 mM PMSF添加) を、培養液50 mLから回収した細胞当り2.0 mL加え、溶解してください。
4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
5. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。アッセイ1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

D. アッセイプロトコール

1. G6PD Assay Buffer (1X) でサンプルを適切な濃度に希釈してください。
2. Total Detection Solution 70 μLとサンプル30 μLを、黒色の96-ウェルプレートに加えてください。よく混ぜ合わせてください。(384-ウェルプレートの場合は、Total Detection Solution 20 μLとサンプル10 μLを加え、混ぜ合わせてください。)
3. ネガティブコントロール：ネガティブコントロール溶液100 μLを3つのウェルに加えてください。 (384-ウェルプレートの場合は、ネガティブコントロール溶液30 μLを加えてください。)
4. ポジティブコントロール：Total Detection Solution 70 μLとポジティブコントロール溶液30 μLを、3つのウェルに加えてください。よく混ぜ合わせてください。(384-ウェルプレートの場合は、Total Detection Solution 20 μLとポジティブコントロール溶液10 μLを加え、混ぜ合わせてください。)
5. 37°Cで15 分間インキュベートしてください。
6. プレートリーダーを用いて、励起波長、蛍光波長それぞれ540 nm、590nmでRFUを測定してください。