Enzyme Immuno Assayプロトコール (EIA)

A. 試薬の調製

1. 使用前に、全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
2. キットに含まれる20X Wash BufferをMilli-Qまたはそれと同等の精製水で希釈し、1X Wash Bufferを調製してください。
3. 10X Cell Lysis Buffer #9803​​をMilli-Qまたはそれと同等の精製水で1Xに希釈してください。Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 1 mMを使用直前に加えてください。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

B. 細胞ライセートの調製

注意：下記には、96ウェルプレート用のプロトコールを示しています。他のウェル数の異なるプレート (6、12、24​、48ウェルなど) を使用する際は、プロトコールを調整してください。

1. 細胞を96ウェルプレートに6-100x10³細胞/ウェルで播種し、適切な培養条件下で一晩インキュベートしてください。
2. 200 μLの暖めたPBSで細胞をすすぎ、無血清培地に希釈した試験化合物を加え、細胞を必要時間インキュベートしてください。
3. 200 μLの氷冷したPBSで細胞をすすぎ、100 μL/ウェルの1X Lysis Bufferを加え、細胞を氷上に5​-10分間保存してください。

注意：細胞のデブリが観察される場合には、プレートを短時間遠心分離することで除去できます。透明な上清を新しい96ウェルプレートに移してください。

C. アッセイ

1. 全てのキット構成品を室温に戻します。
2. HRP標識した標的溶液50 μLとサンプル50 μLを、抗体が固相化されたアッセイプレートに加えてください。プレートを密封したのち、室温で3時間、オービタルシェーカー上でインキュベートしてください。
3. プレートの内容物を捨て、1ウェルあたり200 μLの1X Wash Bufferで4回洗ってください。洗いごとに、各ウェルに残っている液を完全に除去しますが、その際にウェルを完全に乾燥させないようにしてください。
4. TMB基質100 μLを加えてください。
5. 室温で30分間インキュベートしてください。

注意：30分間経過する前に、反応を停止する必要がある場合がありますので、色の変化を注意深く観察してください。

6. STOP溶液100 μLを加えてください。
7. 450 nmの吸光度を測定してください (最適な結果を得るために、STOP溶液を加えてから30分以内にプレートを測定してください)。

注意：試験された化合物の絶対量を決定するために、毎回標準曲線を作成する必要があります。製品データシートにある詳細なプロトコールに従って、標準曲線の濃度幅を決定してください。