次世代シーケンシング (NG-seq) は、CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) アッセイの下流の解析に使用できるハイスループットな手法であり、ゲノム全体にわたる標的DNAの濃縮の特定や定量が可能です。CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systemsキットは、IlluminaシステムプラットフォームでのNG-seq用の、マルチプレックス化したサンプルの調製に適しています。このキットは、最大96種類の異なるバーコードを標識したCUT&Tag DNAライブラリーの調製に使用可能であり、これらのライブラリーは、まとめて一回のシーケンシング反応で解析できます。本製品は、CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561を用いて作成されたCUT&Tag DNAサンプルや、ATAC-seqなどの他のタグメンテーションアッセイで作成されたDNAサンプルにも適しています。本製品は、SimpleChIP® Chromatin IP Kits (#9003, #9005, #56383) を用いて作成されたChIP-DNAや、CUT&RUN Assay Kit (#86652) を用いて作成されたCUT&RUN DNAに適しません。
適合する試薬:
適合しないアッセイキット:
必要な試薬
キットに含まれている試薬:
キットに含まれない試薬:
SAFE STOP | これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 |
デュアルインデックスプライマー方式では、それぞれに8塩基のインデックス配列をもつ、2種類のプライマーを使用します。Index 7 primerは、P7シーケンスに隣接するインデックスを含み、一方、Index 5 primerは、P5シーケンスに隣接するインデックスを含みます。デュアルインデックスでは、シーケンスサンプルの両末端に固有のインデックスを付加します。12種類のIndex 7 primerと、8種類のIndex 5 primerとを組み合わせることで、最大96種類の異なるサンプルを固有にインデックス化することができます。
Illumina社のNG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスには赤色レーザー/LEDを、G/Tのシーケンスには緑色レーザー/LEDを使用しています。各サイクルにつき、赤と緑の両方のチャンネルで読み取り、適切な画像のレジストレーションを行う必要があります (すなわち、各サイクルでAかCが存在し、各サイクルでGかTが存在する必要があります)。インデックスリードのシーケンシングの際、この色のバランスが保たれていないと、失敗の原因となります。各インデックスのシーケンスをチェックして、各サイクルに対して赤と緑両方のチャネルでシグナルを持つインデックスが使用されているかどうかを確認してください。以下の例をご参照ください:
良い例 | |||
---|---|---|---|
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer | ||
Index 701 |
ATTACTCG |
Index 503 |
CCTATCCT |
Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
Index 703 |
CGCTCATT |
Index 505 |
AGGCGAAG |
Index 704 |
GAGATTCC |
Index 506 |
TAATCTTA |
✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✔✔✔✔✔✔ |
悪い例 | ||||
---|---|---|---|---|
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer | |||
Index 701 |
ATTACTCG |
Index 502 |
ATAGAGGC |
|
Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
|
Index 703 |
CGCTCATT |
Index 506 |
TAATCTTA |
|
Index 704 |
GAGATTCC |
Index 508 |
GTACTGAC |
|
✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✘✔✔✘✔✘ |
下の表は、一緒にシーケンスすることができる、有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) を、リスト化したものです。
Plex | Illuminasシステム用のCUT&Tag Index 7 Primers | Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer |
2 | Index 701、Index 702 Index 703、Index 704 Index 705、Index 706 Index 707、Index 708 Index 709、Index 710 Index 711、Index 712 |
任意のIndex 5 Primer |
3 | Index 701、Index 702、Index 703 Index 703、Index 704、Index 705 Index 705、Index 706、Index 707 Index 707、Index 708、Index 709 Index 709、Index 710、Index 711 |
任意のIndex 5 Primer |
4 | Index 701、Index 702、Index 703、Index 704 Index 703、Index 704、Index 705、Index 706 Index 705、Index 706、Index 707、Index 708 Index 707、Index 708、Index 709、Index 710 Index 709、Index 710、Index 711、Index 712 |
任意のIndex 5 Primer |
5-12 | 他のすべてのi7 Primerを含む (必要な場合)、有効な4プレックスのIndex 7の組み合わせ | 任意のIndex 5 Primer |
> 12 | 他のすべてのi7 Primerを含む (必要な場合)、有効なIndex 7 4-plexの組み合わせ | Index 501、Index 502およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 503、Index 504およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 505、Index 506およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 507、Index 508およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) |
その他の有効な組み合わせを下の表にまとめています。CUT&Tag Index 7 primerとCUT&Tag Index 5 primerの有効なセットを選択してください。CUT&Tag Index 7 primerとCUT&Tag Index 5 primerを組み合わせ、必要とするライブラリー数に応じて、PCRに必要なプライマーセットを選定してください。
12 サンプルのプール | (1) 4種類のIndex 7 primerのセット * 3種類のIndex 5 primerのセット (2) 3種類のIndex 7 primerのセット * 4種類のIndex 5 primerのセット (3) 6種類のIndex 7 primerのセット * 2種類のIndex 5 primerのセット |
26 サンプルのプール | (1) 6種類のIndex 7 primerのセット * 4種類のIndex 5 primerのセット 上記に、任意の2種類のIndex 5 primer (上記の4種類以外) と組み合わせた任意のIndex 7 primerを追加 (2) 6種類のIndex 7 primerのセット * 5種類のIndex 5 primerのセット 30種類のprimerペアのうちの26種類を用いて、26種類のライブラリーを増幅 |
各CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systemsは 30 µLの容量で提供されています。
製品 | Index Primerのシーケンス | 予期されるIndex Primerシーケンスリード |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 501 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TATAGCCT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 502 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
ATAGAGGC |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 503 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CCTATCCT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 504 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GGCTCTGA |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 505 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
AGGCGAAG |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 506 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TAATCTTA |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 507 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CAGGACGT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 508 Primer | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GTACTGAC |
-s-はホスホロチオエート結合を示しています。
各CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systemsは 20 µLの容量で提供されています。
製品 | Index Primerのシーケンス | 予期されるIndex Primerシーケンスリード |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 701 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTACTCG |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 702 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGGAGA |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 703 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGCTCATT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 704 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAGATTCC |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 705 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTCAGAA |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 706 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAATTCGT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 707 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CTGAAGCT |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 708 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TAATGCGC |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 709 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGGCTATG |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 710 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGCGAA |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 711 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCTCGCGC |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 712 Primer | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
AGCGATAG |
-s-はホスホロチオエート結合を示しています。
注意:クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。30 µL未満のCUT&Tag DNAでアッセイを開始する場合は、DNAse不含の水を添加し、容量を最大30 µLにします。
試薬 | PCR反応1回分の分量 (70 μL) |
---|---|
CUT&Tag DNA (または任意のタグメンテーションされた DNA) | 30 µL |
CUT&Tag PCR Master Mix | 35 µL |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer (10 µM) | 2.5 µL |
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer (10 µM) | 2.5 µL |
a. | ギャップフィリング | 58°C、5 分間 |
b. | ギャップフィリング拡張 | 72°C、5 分間 |
c. | 初期変性 | 98°C、30秒間 |
d. | 変性 | 98°C、10秒間 |
e. | アニーリングおよび伸長 | 60°Cで11秒間 |
CUT&Tag1反応あたり20,000から100,000個の細胞を用いたサンプルに対しては、ステップdおよびeを合計13サイクル繰り返してください。 | ||
CUT&Tag1反応あたり20,000個以下の細胞を用いたサンプルに対しては、ステップdおよびeを合計14 - 16サイクル繰り返してください。 | ||
注意: PCRサイクルが過剰数であると、ライブラリーの多様性の低下や、NGSリードの重複率の上昇を引き起こす場合があります。 | ||
f. | 最終伸長反応 | 72°C、1分間 |
g. | 保持 (Hold) | 4℃ |
注意:ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
注意:ヒストン修飾の解析用に調製されたCUT&Tag DNAライブラリーは通常、BioanalyzerまたはTapeStationシステム上で確かなシグナルを示しますが、転写因子やコファクターなどのヒストン以外のタンパク質の解析用に調製されたライブラリーは、BioanalyzerまたはTapeStationシステム上で非常に弱いシグナルを示すか、シグナルが全くみえない場合があります。そのような場合でも、高いマッピング率、多数の同定された結合ピーク、全ゲノムにわたる許容されるシグナル対ノイズ比を示すNG-seqの結果を取得できます。そのため、弊社はBioanalyzerまたはTapeStationシステムでシグナルが得られない、シグナルを示さない、転写因子やコファクターの解析用に調製したCUT&TagDNAライブラリーをシーケンシングに進めることを推奨します。