ヒト末梢血単核球 (PBMC) のFoxP3の染色とフローサイトメトリーのプロトコール

以下の製品の専用プロトコールです：

• FoxP3 (D6O8C) Rabbit mAb #12632​
• FoxP3 (D6O8R) XP^® Rabbit mAb #12653

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
3. 2%ホルムアルデヒド (PBS希釈液を実験日当日に用事調製してください)
4. Triton X-100
5. Ficoll-Paque
6. インキュベーションバッファー：Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. 固定

注意：CD4抗体やCD25抗体による細胞表面の抗原の染色は、メーカーの推奨に従って、固定/透過化処理する前の生細胞で行ってください。

1. メーカーのプロトコールに従って、Ficoll密度勾配遠心によりPBMCを全血から単離してください。
2. インキュベーションバッファーを加え、遠心分離により細胞を2回洗ってください。
3. 細胞をインキュベーションバッファーで再懸濁し、チューブ1本あたり1x10⁶細胞/100 μLになるように分注してください。
4. メーカーの推奨する量または濃度に従い、CD4抗体およびCD25抗体をアッセイチューブに加え、氷上で30分間インキュベートしてください。
5. インキュベーションバッファー2 mLを加えて細胞を洗浄し、遠心分離で細胞を集めてください。
6. 上清を吸引除去し、細胞を2%ホルムアルデヒド 500 μLで再懸濁してください。
7. 室温で30分間固定してください。
8. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

C. 透過化処理

1. 細胞を0.1% Triton X-100 (v/v in PBS) 1 mLで再懸濁してください。
2. 30分間室温に置いてください。
3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。

D. 免疫染色

1. FoxP3 (D6O8C) XP^® Rabbit mAb #12632​原液をインキュベーションバッファーで1：200希釈し、細胞ペレットを希釈した抗体液100 μLで再懸濁してください。
2. 室温で1時間インキュベートしてください。
3. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
4. 蛍光色素標識一次抗体を用いた場合は、細胞をインキュベーションバッファー500 μLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。未標識一次抗体やビオチン化一次抗体を用いた場合はステップ5に進んでください。
5. インキュベーションバッファーで推奨通りに希釈した、蛍光標識二次抗体または蛍光標識アビジンで細胞を再懸濁してください。
6. 室温で30分間インキュベートしてください。
7. インキュベーションバッファーを加えて遠心分離し、2回洗ってください。
8. 細胞をインキュベーションバッファー500 μLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。
9. CD4+ Tリンパ球でゲーティングすると、FoxP3とCD25の2パラメーターの散布図が得られます。