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免疫組織化学染色プロトコール - 製品専用プロトコール:12692

次の製品の専用プロトコールです: SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

A. 溶液および試薬

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 脱イオン水 (dH2O)
  4. ヘマトキシリン​ (オプション)
  5. 洗浄バッファー

    注意:洗浄用の10X TBSTが追加で必要になります。

    1. Tris Buffer Saline with Tween®​​ 20 (TBST-10X) #9997:洗浄バッファー (1X TBST) を調製する場合、Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) #9997100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。または
    2. 10X Tris Buffered Saline (TBS): 1 Lを調製する場合、Trizma®​base (C4H11NO3) 24.2 gおよび塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを1 Lの精製水 (dH2O) に加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。1X TBS/0.1% Tween® 20 (1X TBST):1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween® 20​を1 mL加え、混ぜ合わせてください。
  6. 抗体希釈液SignalStain® Antibody Diluent #8112
  7. 抗原賦活化:10 mMクエン酸ナトリウムバッファー:1 Lを調製する場合は、クエン酸三ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O72H2O) 2.94 gを精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。pHを6.0に調整してください。
  8. 3%過酸化水素:調製する場合は、30% H2O2 10​ mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液:1X TBST/5% Normal Goat Serum:10X TBST ​#9997​ 100 μLとNormal Goat Serum #5425​ 50 μL を、精製水 (dH​2​​O)​​ 850 μLに加えてください。
  10. 検出システム:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
  11. 基質:SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 (SignalStain® DAB Diluent #11724 と SignalStain® DAB Chromogen Concentrate #11725が含まれます)
  12. ​ヘマトキシリン:Hematoxylin #14166
  13. 封入剤:SignalStain® Mounting Medium #14177

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

  1. 切片の脱パラフィン/再水和
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 切片を精製水 (dH2O) で各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

  1. 10 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH6.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、10分間沸騰直前の温度を維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 切片を精製水 (dH2O) で、 5分間2回洗ってください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間、洗ってください。
  5. ブロッキング液100-200 μLを各切片に加え、室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、SignalStain® Antibody Diluent #8112で1:500に希釈した一次抗体​100-200 μLを、各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
    1. Rabbit (DA1E) mAb XP® SignalStain® Isotype Control (#12960) をネガティブコントロールとして使用してください。SignalStain® Antibody Diluent #8112で1:500に希釈し、​100-200μLを各切片に加えてください。
  7. SignalStain® Boost Detection Reagent #8114を室温に戻してください。
  8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
  9. 必要に応じて、1-3滴のSignalStain® Boost Detection Reagent #8114を滴下して、切片を覆ってください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
  10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  11. 使用前に、SignalStain® DAB Chromogen Concentrate #11725 30 μLをSignalStain® DAB Diluent #11724 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. SignalStain® DAB 100​ - 400 μLを各切片に加え、注意深く観察してください。 通常、1 - 10分間で、十分な染色が得られます。
  13. スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  14. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  15. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  16. 切片を脱水してください​:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  17. カバーガラスで封入してください。

更新:2013年7月

改訂日:2021年3月

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