免疫組織化学染色プロトコール - 製品専用プロトコール：12692

次の製品の専用プロトコールです： SignalStain^® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

A. 溶液および試薬

1. キシレン
2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
3. 脱イオン水 (dH₂O)
4. ヘマトキシリン​ (オプション)

5. 洗浄バッファー

   注意：洗浄用の10X TBSTが追加で必要になります。

   1. Tris Buffer Saline with Tween^®​​ 20 (TBST-10X) #9997：洗浄バッファー (1X TBST) を調製する場合、Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST-10X) #9997100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えてください。または
   2. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： 1 Lを調製する場合、Trizma^®​base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gおよび塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを1 Lの精製水 (dH₂O) に加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。1X TBS/0.1% Tween^® 20 (1X TBST)：1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えてください。Tween^® 20​を1 mL加え、混ぜ合わせてください。
6. 抗体希釈液：SignalStain^® Antibody Diluent #8112
7. 抗原賦活化：10 mMクエン酸ナトリウムバッファー：1 Lを調製する場合は、クエン酸三ナトリウム二水和物 (C₆H₅Na₃O₇•₂H₂O) 2.94 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。pHを6.0に調整してください。
8. 3%過酸化水素：調製する場合は、30% H₂O₂ 10​ mLを精製水 (dH₂O) 90 mLに加えてください。
9. ブロッキング液：1X TBST/5% Normal Goat Serum：10X TBST ​#9997​ 100 μLとNormal Goat Serum #5425​ 50 μL を、精製水 (dH​_2​​O)​​ 850 μLに加えてください。
10. 検出システム：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
11. 基質：SignalStain^® DAB Substrate Kit #8059 (SignalStain^® DAB Diluent #11724 と SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate #11725が含まれます)
12. ​ヘマトキシリン：Hematoxylin #14166
13. 封入剤：SignalStain^® Mounting Medium #14177

B. 脱パラフィン/再水和

注意：操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

1. 切片の脱パラフィン/再水和：
   1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
   2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
   3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
2. 切片を精製水 (dH₂O) で各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

1. 10 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH6.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、10分間沸騰直前の温度を維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。

D. 染色

1. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、3回洗浄してください。
2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
3. 切片を精製水 (dH₂O) で、 5分間2回洗ってください。
4. 洗浄バッファーで切片を5分間、洗ってください。
5. ブロッキング液100-200 μLを各切片に加え、室温で1時間ブロッキングしてください。
6. ブロッキング液を除去し、SignalStain^® Antibody Diluent #8112で1：500に希釈した一次抗体​100-200 μLを、各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
   1. Rabbit (DA1E) mAb XP^® SignalStain^® Isotype Control (#12960) をネガティブコントロールとして使用してください。SignalStain^® Antibody Diluent #8112で1：500に希釈し、​100-200μLを各切片に加えてください。
7. SignalStain^® Boost Detection Reagent #8114を室温に戻してください。
8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
9. 必要に応じて、1-3滴のSignalStain^® Boost Detection Reagent #8114を滴下して、切片を覆ってください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
11. 使用前に、SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate #11725 30 μLをSignalStain^® DAB Diluent #11724 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
12. SignalStain^® DAB 100​ - 400 μLを各切片に加え、注意深く観察してください。 通常、1 - 10分間で、十分な染色が得られます。
13. スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
14. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
15. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
16. 切片を脱水してください​：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
17. カバーガラスで封入してください。