次の製品の専用プロトコールです: ROS1 (D4D6®) Rabbit mAb #3287
*重要:適切な抗体希釈率については製品データシートを参照してください。
A. 溶液および試薬
- キシレン
- エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
- 脱イオン水 (dH2O)
- ヘマトキシリン (オプション)
- 洗浄バッファー:
1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween-20 1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
10X Tris Buffered Saline (TBS): 1 Lを調製する場合は、Trizma®base (C4H11NO3) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。 - 抗体希釈液: SignalStain® Antibody Diluent (#8112)
- 抗原賦活化:EDTA:1 mM EDTA:1 Lを調製する場合は、EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。pHを8.0に調整してください。
- 3%過酸化水素水:調製する場合は、30% H2O2 10 mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
- ブロッキング液: TBST/5%Normal Goat Serum:1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
- 検出システム:SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
- 基質:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059) キットの推奨に従って調製してください。
B. 脱パラフィン/再水和
注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。
- 切片の脱パラフィン/水和:
- キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
- 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
- 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
- 切片を精製水 (dH2O) で各5分間、2回洗ってください。
C. 抗原賦活化
注意:この手順は、Decloaking Chamber (Biocare Medical社) を用いて最適化されています。他の抗原賦活化装置では、設定や操作方法が異なります。
- 室温の抗原賦活化用1.0 mM EDTA (pH 8.0) 250 mLを入れた24スライド用ホルダーにスライドを入れてください。
- 精製水 (dH2O) 500 mLを圧力釜に注ぎ入れてください。
- スライドホルダーをヒートシールドの上に乗るよう自動抗原賦活化装置 (圧力釜) 内に置いてください。ブランクのスライドと精製水250 mLが入った24枚用スライドホルダーも圧力釜に入れておくことをお勧めします。
- 蓋を閉めて、賦活化を進めてください。Decloaking Chamberの設定は以下のようにしてください。
- SP1 125°C 30秒間
- SP2 90°C 10秒間
- 慎重に蒸気を抜き、フタを開けて、スライドを実験台の上で10分間冷却してください。
- スライドを精製水 (dH2O) で洗ってください。
D. 染色
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗浄してください。
- 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
- 切片を精製水 (dH2O) で、 5分間2回洗ってください。
- 洗浄バッファーで切片を5分間、洗ってください。
- ブロッキング液100-400 µLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
- ブロッキング液を除去し、SignalStain® Antibody Diluent (#8112) で希釈した一次抗体100-300 μLを各切片に加えてください。一晩4℃でインキュベートしてください。
- SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) を室温に戻してください。
- 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
- SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) を1-2滴ずつ、各切片に加えてください。30分間室温でインキュベートしてください。
- SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) の液を除去し、切片を洗浄バッファーで各5分間ずつ、3回洗ってください。
- SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059) 100-400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
- 十分に発色したら、スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
- 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
- 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
- 切片を脱水してください:
- 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
- カバーガラスで封入してください。