免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片) - 製品専用プロトコール：3287

次の製品の専用プロトコールです： ROS1 (D4D6^®) Rabbit mAb #3287

*重要：適切な抗体希釈率については製品データシートを参照してください。

A. 溶液および試薬

1. キシレン
2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
3. 脱イオン水 (dH₂O)
4. ヘマトキシリン​ (オプション)
5. 洗浄バッファー：
   1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)： 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
   10X Tris Buffered Saline (TBS)： 1 Lを調製する場合は、Trizma^®​base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。
6. 抗体希釈液： SignalStain^® Antibody Diluent (#8112)
7. 抗原賦活化：EDTA：1 mM EDTA：1 Lを調製する場合は、EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 0.372 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。pHを8.0に調整してください。
8. 3%過酸化水素水：調製する場合は、30% H₂O₂ 10​ mLを精製水 (dH₂O) 90 mLに加えてください。
9. ブロッキング液： TBST/5%Normal Goat Serum：1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum (#5425) 250 µLを加えてください。
10. 検出システム：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
11. 基質：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059) キットの推奨に従って調製してください。

B. 脱パラフィン/再水和

注意：操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

1. 切片の脱パラフィン/水和：
   1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
   2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
   3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
2. 切片を精製水 (dH₂O) で各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

注意：この手順は、Decloaking Chamber (Biocare Medical社) を用いて最適化されています。他の抗原賦活化装置では、設定や操作方法は異なります。

1. 室温の抗原賦活化用1.0 mM EDTA (pH 8.0​) 250 mLを入れた24スライド用ホルダーにスライドを入れてください。
2. 精製水 (dH₂O) 500 mLを圧力釜に注ぎ入れてください。
3. スライドホルダーをヒートシールドの上に乗るよう圧力釜内に置いてください。ブランクのスライドと精製水​250 mLが入った24枚用スライドホルダーも圧力釜に入れておくことをお勧めします。
4. フタを閉めて、賦活化を進めてください。Decloaking Chamberの設定は以下のようにしてください。
   1. SP1 125°C 30秒間
   2. SP2 90°C 10秒間
5. 慎重に蒸気を抜き、フタを開けて、スライドを実験台の上で10分間冷却してください。
6. スライドを精製水 (dH₂O) で洗ってください。

D. 染色

1. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、3回洗浄してください。
2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
3. 切片を精製水 (dH₂O) で、 5分間2回洗ってください。
4. 洗浄バッファーで切片を5分間、洗ってください。
5. ブロッキング液100-400 µLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
6. ブロッキング液を除去し、SignalStain^®​ Antibody Diluent (#8112) で希釈した一次抗体100-300 μLを各切片に加えてください。一晩4℃でインキュベートしてください。
7. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) を室温に戻してください。
8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
9. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114) を1-2滴ずつ、各切片に加えてください。30分間室温でインキュベートしてください。
10. SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114​) の液を除去し、切片を洗浄バッファーで各5分間ずつ、3回洗ってください。
11. SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059) 100​-400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
12. 十分に発色したら、スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
13. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
14. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
15. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
16. カバーガラスで封入してください。