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フローサイトメトリー (標識二次抗体を使用した細胞外標的染色プロトコール)

A. 溶液および試薬

  1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS): NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 gを、精製水 (dH2O) 800 mLに溶解してください。HClを用いてpHを7.4​​に調整し、精製水を加えて1 Lにしてください。室温で保存してください。
  2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. インキュベーションバッファー: Bovine Serum Albumin (BSA) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. 固定

  1. 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
  2. 細胞をPBS 0.5​-1 mLで軽く再懸濁してください。終濃度が2​-4%になるようにホルムアルデヒドを加えてください。
  3. 37°Cで10分間固定してください。
  4. PBS 5 mLを加え、遠心分離によりすすいでください。
  5. 細胞をPBS 5​ mLに再懸濁してください。
  6. 染色に進むか、細胞を0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS中で4°Cに保存してください。

C. 非標識一次抗体と標識二次抗体を使用した染色

注意:モノクローナル抗体にはアイソタイプコントロールを、またポリクローナル抗体には動物種を合わせたIgGをコントロールとして使用してください。細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

  1. 0.5-1x106細胞を各アッセイチューブに分注してください。
  2. インキュベーションバッファー 2​-3 mLを各チューブに加え、遠心分離によりすすいでください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  3. アッセイチューブごとに、インキュベーションバッファー100 μLで細胞を再懸濁してください。
  4. 室温で10分間、インキュベーションバッファーでブロッキングしてください。
  5. 適切に希釈された標識一次抗体をアッセイチューブに加えてください (推奨希釈率についてはの抗体データシートを参照)。
  6. 30​-60分間室温でインキュベートしてください。
  7. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
  8. メーカーの推奨に従って蛍光標識二次抗体*をインキュベーションバッファーで希釈し、細胞を再懸濁してください。
  9. 室温で30分間インキュベートしてください。
  10. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
  11. 細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

抗マウス

抗ラット

更新:2009年1月

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