フローサイトメトリー (標識二次抗体を使用した細胞外標的染色プロトコール)

A. 溶液および試薬

1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS)： NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、KH₂PO₄ 0.24 gを、精製水 (dH₂O) 800 mLに溶解してください。HClを用いてpHを7.4​​に調整し、精製水を加えて1 Lにしてください。室温で保存してください。
2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
3. インキュベーションバッファー： Bovine Serum Albumin (BSA) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。

B. 固定

1. 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
2. 細胞をPBS 0.5​-1 mLで軽く再懸濁してください。終濃度が2​-4%になるようにホルムアルデヒドを加えてください。
3. 37°Cで10分間固定してください。
4. PBS 5 mLを加え、遠心分離によりすすいでください。
5. 細胞をPBS 5​ mLに再懸濁してください。
6. 染色に進むか、細胞を0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS中で4°Cに保存してください。

C. 非標識一次抗体と標識二次抗体を使用した染色

注意：モノクローナル抗体にはアイソタイプコントロールを、またポリクローナル抗体には動物種を合わせたIgGをコントロールとして使用してください。細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

1. 0.5-1x10⁶細胞を各アッセイチューブに分注してください。
2. インキュベーションバッファー 2​-3 mLを各チューブに加え、遠心分離によりすすいでください。繰り返す。
3. アッセイチューブごとに、インキュベーションバッファー100 μLで細胞を再懸濁してください。
4. 室温で10分間、インキュベーションバッファーでブロッキングしてください。
5. 適切に希釈された標識一次抗体をアッセイチューブに加えてください (推奨希釈率についてはの抗体データシートを参照)。
6. 30​-60分間室温でインキュベートしてください。
7. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
8. メーカーの推奨に従って蛍光標識二次抗体*をインキュベーションバッファーで希釈し、細胞を再懸濁してください。
9. 室温で30分間インキュベートしてください。
10. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
11. 細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

抗マウス

• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410

抗ラット

• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418