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BrdU抗体を用いた免疫蛍光染色プロトコール

次の製品の専用プロトコールです: BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292

A. 溶液および試薬

注意:Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  • 10X Phosphate Buffered Saline (PBS): 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
  • BrdU (5-Bromo-2′-deoxyuridine) EMD biosciences (Cat. #203806)
  • エタノール、変性70%、溶液、American Bioanalytical (Cat. #CU00844)
  • 1.5 M塩酸
  • ブロッキングバッファー (1X PBS/5% Normal Goat Serum (#5425)/0.3% Triton™ X-100):
    25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mL、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清1.25 mL (例えば、正常ヤギ血清、正常ロバ血清) を精製水 (dH2O) 21.25 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 75 μLを加えてください。
  • 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA):
    40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH2O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。
  • 蛍光色素標識二次抗体推奨される二次抗体
    注意:初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。
  • Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071) with DAPI (#8961)。

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

BrdUの取り込み: BrdUを事前に温めた新しい増殖培地で、最終濃度が0.03 mg/mLになるように希釈してください。希釈液を細胞に加え、37℃で30分間インキュベートしてください。

  1. 培地を吸引し、冷却した70%エタノールで完全に細胞を覆ってください。
  2. 細胞を室温で5分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
  4. 1.5 M HClを加えて30分間室温でインキュベートしてください。
  5. HClを吸引し、PBSで各5分間、2回洗ってください。
  6. 免疫染色に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. PBSで各5分間、3回洗ってください。
  6. 検体に抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体*を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
  7. ステップ5と同様にPBSで洗ってください。
  8. Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) with DAPI (#8961) を加えてスライドをカバーガラスで覆ってください。マルチウェルプレートの場合は細胞を十分覆う量のReagent (with DAPI) を加えてください。
  9. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で水平にして保存してください。

*推奨二次抗体:

抗マウス

更新:2009年11月

改訂日:2010年12月

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