次の製品の専用プロトコールです： BrdU (Bu20a) Mouse mAb #5292
A. 溶液および試薬
注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。
- 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
- BrdU (5-Bromo-2′-deoxyuridine) EMD biosciences (Cat. #203806)
- エタノール、変性70%、溶液、American Bioanalytical (Cat. #CU00844)
- 1.5 M塩酸
- ブロッキングバッファー (1X PBS/5% Normal Goat Serum (#5425)/0.3% Triton™ X-100)：
25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mL、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清1.25 mL (例えば、正常ヤギ血清、正常ロバ血清) を精製水 (dH2O) 21.25 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 75 μLを加えてください。 - 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA)：
40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH2O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。 - 蛍光色素標識二次抗体（推奨される二次抗体）
注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。 - Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071) またはProlong Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)
注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。
BrdUの取り込み： BrdUを事前に温めた新しい増殖培地で、最終濃度が0.03 mg/mLになるように希釈してください。希釈液を細胞に加え、37℃で30分間インキュベートしてください。
- 培地を吸引し、冷却した70%エタノールで完全に細胞を覆ってください。
- 細胞を室温で5分間固定してください。
- 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
- 1.5 M HClを加えて30分間室温でインキュベートしてください。
- HClを吸引し、PBSで各5分間、2回洗ってください。
- 免疫染色に進んでください (セクションC)。
C. 免疫染色
注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。
- ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
- ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
- ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
- 4℃で一晩インキュベートしてください。
- PBSで各5分間、3回洗ってください。
- 検体に抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体*を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
- ステップ5と同様にPBSで洗ってください。
- DAPI (#8961) を添加したProlong Gold Antifade Reagent (#9071) を加えて、スライドをカバーガラスで覆ってください。マルチウェルプレートの場合は細胞を十分覆える量の試薬を加えてください。
- 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で水平にして保存してください。
*推奨二次抗体:
抗マウス
