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BrdU Cell Proliferationプロトコール

次の製品の専用プロトコールです: BrdU Cell Proliferation Assay Kit #6813.

A. 試薬の調製

  1. BrdU ELISA Kitキットに含まれる20X Wash Bufferを精製水で希釈し、1X 洗浄バッファーを調製してください。
  2. BrdU Detection AntibodyをDetection Antibody Diluent (緑色) で100倍希釈し、1X 検出抗体溶液を調製してください。
  3. Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyをHRP-linked Antibody Diluent (赤色) で100倍希釈し、1X HRP標識二次抗体溶液を調製してください。
  4. BrdUを細胞培養液で100倍希釈し、10X BrdU溶液を調製してください。

B. BrdUの取り込み

  1. 細胞を96-ウェルプレートに捲き込み、実験目的に応じて試験化合物等で処理してください。細胞増殖速度によりますが、典型的な播種細胞数は、2500–100000細胞/ウェルです。通常のインキュベーション時間は1–72時間です。
  2. 調製した10X BrdU溶液をプレートのウェルに加え、最終濃度を1Xにしてください。例: プレート内の100 µLの培地には、1 well当たり10X BrdU溶液10 µLを加えてください。
  3. 細胞をインキュベーターに入れてください。通常のインキュベーション時間は1–24時間です。
  4. 培地を取り除いてください。浮遊細胞の場合、プレートを300 gで10分間遠心分離した後、培地を取り除いてください。

C. BrdUアッセイ

  1. 100 µL/ウェルのFixing/Denaturing Solutionを加え、プレートを室温で30分間静置した後、溶液を除去してください。
  2. 100 µL/ウェルの1X 検出抗体溶液を加え、プレートを室温に1時間静置してください。溶液を除去し、プレートを1X 洗浄バッファーで3回洗ってください。
  3. 100 µL/ウェルの1X HRP標識二次抗体溶液を加え、プレートを室温に30分間置いてください。溶液を除去し、プレートを1X 洗浄バッファーで3回洗ってください。
  4. TMB Substrate (#7004) 100 μLを加えてください。
  5. 室温で30分間インキュベートしてください。

注意:標準発色時間である30分間が経過する前に、反応停止が必要な場合がありますので、色の変化をよく観察してください。

  1. STOP Solution (#7002) 100 μLを加えてください。
  2. 450 nmの吸光度を測定してください (最適な結果を得るためには、STOP Solutionを加えてから30分以内にプレートを測定してください)。

更新:2012年10月

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