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免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン切片) -製品専用プロトコール:9319

次の製品の専用プロトコールです: Tyrosinase (T311) Mouse mAb (IHC Specific) #9319

A. 溶液および試薬

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 精製水 (dH2O)
  4. ヘマトキシリン (オプション)
  5. 洗浄バッファー:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
    10X Tris Buffered Saline (TBS): (#9997):1 Lを調製する場合は、Trizma®​base (C4H11NO3) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。HClでpHを7.6に調整してください。
  6. 抗体希釈液: SignalStain® Antibody Diluent (#8112)
  7. 抗原賦活化:TE:10 mM Tris/1 mM EDTA、pH 9.0:1 Lを調製する場合は、Trizma®base (C4H11NO3) 1.21 gとEDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを、精製水 (dH2O) 950 mLに加えてください。pHを9.0に調整し、精製水 (dH2O) で全量を1000 mLにしてください。
  8. 3%過酸化水素水:調製する場合は、30% H2O2 10​ mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液: TBST/5% Normal Goat Serum (#5425):1X TBST 5 mLに、Normal Goat Serum 250 µLを加えてください。
  10. SignalStain® Boost IHCDetection Reagent (HRP, Mouse) (#8125)
  11. DAB試薬または適切な基質: メーカーの推奨に従って調製してください。

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C. 抗原賦活化

  1. 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、18分間沸騰直前の温度を維持してください。室温で30分間冷却してください。

D. 染色

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素水で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
  5. ブロッキング液100​-400 µLを各切片に加え、室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、推奨の抗体希釈液で希釈した一次抗体100​-400 μLを各切片に添加してください。30分間室温でインキュベートしてください。
  7. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125) の試薬を室温に戻してください。
  8. 抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
  9. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125) を1–2ずつ、各切片に加えてください。30分間室温でインキュベートしてください。
  10. SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) (#8125) の液を除去し、切片を洗浄バッファーで各5分間ずつ、3回洗ってください。
  11. DABまたは適切な基質100​-400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
  12. 十分に発色したら、スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  13. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  14. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
  15. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
  16. カバーガラスで封入してください。

更新:2010年11月

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