PathScan^® Sandwich ELISAプロトコール (化学発光ELISA)

注意：アッセイのインキュベーション温度については、製品のデータシートを参照してください。化学発光ELISAは、低容量のマイクロプレートを採用しています。各マイクロウェルごとに必要なサンプル量と試薬量は50 μLです。 

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、10X PBS 50 mLと精製水 (dH₂O) 950 mLを混ぜ合わせてください。
2. 使用前に、全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
3. キットに含まれる20X Wash Bufferを精製水 (dH₂O) で希釈し、1X Wash Bufferを調製してください。

4. 1X Cell Lysis Buffer​：10X Cell Lysis Buffer (#9803)：1X Cell Lysis Buffer 10 mLを調製するために、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH₂O) 9 mLに加えて混ぜ合わせてください。PathScan^® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1X：このバッファーは、ready to useです。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

   推奨​：1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (#8553) を使用直前に加えてください。

   注意：溶解バッファーの推奨については、製品のデータシートまたはウェブページを参照してください。

5. 20X LumiGLO^® Reagentと20X Peroxide​：(#7003)

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

1. 密度が​80​-90%コンフルエントの細胞を用意し、培地を吸引除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
5. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
6. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

1. 解析対象となる細胞を増殖させ、生細胞密度が0.5​-1.0 x 10⁶細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1,200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 低速遠心分離 (~1,200 rpm) により細胞を回収し、5​-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
5. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要な数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーにセットしてください。未使用のマイクロウェルは、保存バッグ中に再度密封して直ちに4°Cで保存してください。
2. 細胞ライセートは、そのまま、あるいは各PathScan^®​Sandwich ELISA キットに含まれてる青色のサンプル希釈液により希釈して、使用してください。ライセートの適切な希釈率とアッセイ結果に関する情報は、各キットのデータシートあるいは製品のウェブページに記載されています。
3. 適切なウェルに、未希釈、あるいは希釈した各細胞ライセート50 μLを加えてください。テープで密封し、マイクロウェルの上からきつく押し付けてください。室温で2時間、プレートをインキュベートしてください。あるいは、プレートを4°Cで一晩インキュベートすることも可能です。
4. ​静かにテープを取り除き、ウェルを洗ってください:
   1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
   2. 各ウェルを1X Wash Buffer 150​ μLで4回洗ってください。
   3. 各洗いの操作で、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
   4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。
5. 各ウェルに、検出抗体 (緑色) 50 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを室温で1時間インキュベートしてください。
6. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
7. HRP標識二次抗体 (赤色) 50 μLを各ウェルに加えてください。テープで密封し、プレートを室温で30分間インキュベートしてください。
8. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
9. 2X LumiGLO^®と2X Peroxideを等量ずつ混合し、検出試薬のワーキング溶液を調製してください。
10. 各ウェルに検出試薬のワーキング溶液50 μLを加えてください。
11. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425​ nmでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。
    1. 10分以内に測定した場合に至適なシグナル強度が得られます。