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血液サンプルを用いた細胞内タンパク質と細胞表面マーカーの多重染色プロトコール (Flow Alternate)

重要:製品がフローサイトメトリー (F) を使用して検証され、使用可能であるかどうかについては、データシートまたは製品ウェブページの最初のページにあるApplicationsセクションをご参照ください。このプロトコールは全血を用いた共染色に対する一般的なアプローチとして提供されていますが、CSTは全てのフローサイトメトリー推奨抗体について、このプロトコールを用いた検証を実施していません。適切な固定、透過化条件、および推奨される抗体の希釈率は、製品ウェブページの製品特有のFlowプロトコールをご参照ください。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS) (#9808): 1X PBS 1 Lを用意する場合:20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  2. 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. Triton™ X-100:0.1% Triton™ X-100を50 mL用意するには、Triton™ X-100 50 μLを1X PBS 50 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  4. 50%メタノール
  5. インキュベーションバッファー:Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。
  6. 二次抗体:Anti-mouse (#4408#8890#4410#8887)、Anti-rabbit (#4412#8889#4414#8885)、Anti-rat (#4416#4418)。

B. 全血サンプルの調製 (固定、赤血球溶解、透過化処理)

  1. 新鮮な全血100 μLをアッセイチューブに分注してください。
  2. オプション:37°Cのウォーターバスに入れたラックにチューブを設置し、リガンド、阻害剤、薬剤などでの短時間処理してください。
  3. 各チューブに10%ホルムアルデヒド65 μLを加えてください。
  4. 手早くボルテックスし、室温に15分間置いてください。
  5. 各チューブに0.1% Triton™ X-100 1 mLを加えてください。
  6. ボルテックスし、室温に30分間置いてください。
  7. インキュベーションバッファー1 mLを加えてください。
  8. 遠心分離により細胞を集め、上清を吸引してください。
  9. ステップ7と8を繰り返してください。
  10. PBSで希釈して氷冷した50%メタノールに細胞を再懸濁してください (使用するまでメタノール溶液は-20°Cで保存してください)。
  11. 氷上で少なくとも10分間インキュベートしてください。
  12. 染色操作に進むか、細胞を50%メタノール中で-20°Cに保存してください。

C. 非標識一次抗体と標識二次抗体を使用した染色

注意:モノクローナル抗体にはアイソタイプコントロールを、またポリクローナル抗体には同じ動物種のIgGをコントロールとして用意してください。

  1. 各チューブにインキュベーションバッファー2-3 mLを加え、遠心分離により洗ってください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  2. データシートまたは製品ウェブページの推奨に従って、インキュベーションバッファーで希釈した一次抗体を加えてください。
  3. 室温で30–60分間インキュベートしてください。
  4. インキュベーションバッファー2–3 mLを加え、遠心分離により洗ってください。直接標識抗体を使用している場合は、ステップ8​へ進んでください。
  5. メーカーの推奨に従ってインキュベーションバッファーで希釈した蛍光標識二次抗体で細胞を再懸濁してください。
  6. 室温で30分間インキュベートしてください。
  7. インキュベーションバッファー2–3 mLを加え、遠心分離により洗ってください。
  8. 細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

参考文献:Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.

更新:2008年11月

改訂日:2017年7月

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