HRP Chemiluminescent ELISA-P (HRP化学発光ELISA-P)

A. 溶液および試薬

1. 炭酸バッファー： 15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。1 μMとなるように、合成ペプチドを加えた炭酸バッファーを使用してください。
2. 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム(Na₂HPO₄) 14.4g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
3. 洗浄バッファー：0.05% Tween^® 20​含有1X PBS (PBST)
4. ブロッキングバッファー：​10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を含むPBST
5. 一次抗体希釈バッファー： 1 mg/mL BSA含有PBST
6. 二次抗体希釈バッファー： 3% BSA含有PBST
7. 96ウェルプレート： 化学発光の検出のために、ソリッドホワイトまたは不透明プレートをご使用ください。

B. ペプチドの固相化

1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、1 μMで合成ペプチドを加えた炭酸バッファー溶液100 μLを加え、4°Cで一晩、もしくは37°Cで2​-6時間インキュベートすることにより、プレートにペプチドを固相化してください。もしペプチドが結合されない場合には、pH 4​-8の範囲の他のバッファーで試してください。
2. 1ウェルあたり200 μLの洗浄バッファーで、プレートを3回洗ってください。
3. 1ウェルあたり​200 μLのブロッキングバッファーを加え、37°Cで1時間インキュベートし、プレートをブロッキングしてください。洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。(必要に応じて、乾燥したプレートを4°Cで1-2ヵ月間保存することも可能です。)

C. HRP標識一次抗体を使用する場合

1. 一次抗体希釈バッファーを用いて、HRP標識一次抗体を推奨希釈率で希釈してください。各ウェルに​100 μLを加え、37°Cで1時間インキュベートしてください。
2. 洗浄バッファーで5回洗ってください。
3. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
4. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425 nmでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。
5. 10分以内に測定した場合に至適なシグナル強度が得られます。

D. HRP標識二次抗体を使用する場合

1. 一次抗体希釈バッファーを用いて、一次抗体を推奨希釈率で調製してください。全ウェルに対して100 μLを加え、4°Cで一晩インキュベートするか、37°Cで2​-6時間インキュベートしてください。
2. 洗浄バッファーでプレートを3回洗ってください。
3. 二次抗体希釈バッファーを用いて、HRP標識二次抗体​を推奨希釈率で希釈してください。各ウェルに​100 μLを加え、37°Cで1時間インキュベートしてください。
4. 洗浄バッファーで5回洗ってください。
5. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合したワーキング溶液を調製してください。
6. プレート用ルミノメーターを用いて、基質を加えてから1-10分以内に、425 nmでの相対発光量 (Relative Light Units : RLU) を測定してください。
7. 10分以内に測定した場合に至適なシグナル強度が得られます。

*推奨されるHRP標識二次抗体：

• Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074
• Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076
• Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody #7077​