Image-iT FX Signal Enhancerを用いた免疫蛍光染色プロトコール

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

• ​10X Phosphate Buffered Saline (PBS)：
  1 Lを調製する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸二水素カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを、精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
• ホルムアルデヒド (16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814))：新しい物を使用し、開封した瓶は暗所4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。
• 透過化バッファー (1X PBS/0.2% Triton X-100)：
  25 mLを調製するために、10X PBS 2.5 mLを精製水 (dH₂O) 22.5 mLに加えて、よく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 50 μLを加えてください。
• Image-iT FX Signal Enhancer (#11932)
• ブロッキングバッファー (1X PBS/5% Normal Goat Serum (#5425)/0.3% Triton™ X-100)：
  25 mLを用意する場合は、10X PBS 2.5 mLと正常ヤギ血清1.25 mL、精製水 (dH₂O) 21.25 mLを加えて、よく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 75 μLを加えてください。
• 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA/0.3% TritonX-100)：
  40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH₂O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。撹拌しながら、Triton X-100 120 μLを加えてください。
• Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071) またはProlong Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で、直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

1. 培地を吸引除去し、4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) を細胞が2～3 mm浸る程度に加えてください。
   注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
2. 細胞を室温で15分間固定してください。
3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

1. 細胞に透過化バッファーを加え、室温で5分間透過化処理してください。
2. PBSで各5分間、3回洗ってください。
3. Image-iT FX Signal Enhancer (#11932) 3​-4滴を添加し、室温で30分間インキュベートしてください。
4. PBSで各5分間、3回洗ってください。
5. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
6. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
7. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
8. 4℃で一晩インキュベートしてください。
9. PBSで各5分間、3回洗ってください。
10. Prolong Gold Antifade Reagent (#9071) またはProlong Gold Antifade Reagent with DAPI#8961) を加え、カバーガラスで封入してください。
11. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。