メタノール固定を必要とする細胞アッセイの免疫蛍光染色プロトコール

重要： このプロトコールは未標識抗体および蛍光標識抗体の両方での使用をお勧めします。製品のウェブページの製品使用情報または製品データシートでご利用の製品が培養細胞株 (IF-IC) で検定済みであることをご確認ください。

注意：CST®抗体には、本セクションとは異なるプロトコールで最良の結果が得られるものもいくつかあります。各製品の推奨条件は製品ウェブページのプロトコールをご確認ください。

A. 溶液および試薬

より高品質な免疫蛍光染色像を得るため、効率的で経済的な弊社Immunofluorescence Application Solutions Kit (#12727) をご利用ください。

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS)： 1X PBSを1 L調製する場合は、10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline (#12528) 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えて混合し、pHを8.0に調整してください。
2. Methanol： (#13604) 100%、氷冷したものを使用してください。
3. ブロッキングバッファー：そのまま使用できるImmunofluorescence Blocking Buffer (#12411) を購入してください。あるいは、二次抗体と同じ動物種の正常血清0.5 mL (例：Normal Goat Serum (#5425)) と30 µL Triton X-100を1X PBS 9.5 mLに加えてよく混合し、1X PBS/5%正常血清/0.3% Triton X-100バッファーを調製してください。4℃で保存してください。
4. 抗体希釈バッファー： そのまま使用できるImmunofluorescence Antibody Dilution Buffer (#12378) を購入してください。あるいは、 BSA (#9998) 0.1 gとTriton X-100 30 µLを1X PBS 10 mLに加え、1X PBS/ 1% BSA/0.3% Triton X-100バッファーを調製してください。4℃で保存してください。
5. 蛍光標識二次抗体： 使用する一次抗体の宿主生物種 (例：ラビット) に対応した二次抗体を選択してください。免疫蛍光染色検証済み二次抗体の一覧はこちら。

B. 固定

注意：特に記載がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温 (20 - 25°C) で行ってください。

1. 培地を吸引除去し、2-3 mmの深さの氷冷した100%メタノールで細胞を覆ってください。
2. 細胞を4°Cで15分間固定してください。
3. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
2. ブロッキングの間に、一次抗体を抗体希釈バッファーに希釈してください (推奨希釈率はデータシートに記載されています)。
3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. 1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。

注意：蛍光標識された一次抗体を使用する場合は、セクションCのステップ8に進んでください。

6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、遮光して1 - 2時間インキュベートしてください。
7. 遮光して1X PBSで3回、5分間ずつ洗浄してください。
8. 必要に応じて対比染色を行ってください。

注意：実験に蛍光細胞染色色素 (DNA色素など) を使用する場合は、色素の製品ページの推奨プロトコールを参照してください。免疫蛍光染色で検証済みの細胞染色色素一覧はこちら。

9. イメージング用サンプルを封入してください。
10. サンプルを長期保存する場合は、遮光して4℃で保存してください。