免疫蛍光染色プロトコール (透過化処理なし)

重要： データシート最初のページのアプリケーションセクションを参照し、製品が培養細胞株 (IF-IC) または凍結組織切片 (IF-F) の蛍光免疫染色で検証され、推奨されているかどうかをご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

• 10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを準備する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを8.0に調整してください。
• ホルムアルデヒド、16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814)：新しい物を使用し、開封した瓶は暗所4°Cで保存し、使用の際はPBSで希釈してください。
• ブロッキングバッファー (1X PBS/5% Normal Goat Serum (#5425))：
  25 mLを調製する場合は、10X PBS 2.5 mL、二次抗体の免疫動物と同種の正常血清1.25 mL (例えば、正常ヤギ血清、正常ロバ血清) を精製水 (dH₂O) 21.25 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。
• 抗体希釈バッファー (1X PBS/1% BSA)：
  40 mLを調製する場合は、10X PBS 4 mLを精製水 (dH₂O) 36 mLに加えて混ぜ合わせてください。0.4 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。
• 蛍光色素標識二次抗体（推奨される二次抗体）
  注意：初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために抗体のタイトレーションを行ってください。
• ​Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071) with DAPI (#8961)。

B. 試料作製

I. 培養細胞株 (IF-IC)

注意：マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

1. 培地を吸引除去し、4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) を細胞が2～3 mm浸る程度に加えてください。
   注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
2. 細胞を室温で15分間固定してください。
3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回洗ってください。
4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

II. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

1. 固定済み凍結組織切片の場合、免疫染色操作に進んでください (セクションC)。
2. 作製したての未固定の凍結切片の場合は、下記方法で直ちに固定してください。
   1. 2–4%ホルムアルデヒド (PBSで希釈) に切片を浸してください。
      注意：ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。
   2. 切片を室温で15分間固定してください。
   3. PBSでスライドを各5分間、3回洗ってください。
   4. 免疫染色 (セクションC) に進んでください。

C. 免疫染色

注意：特に記載がない限り、下記全てのインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色を防ぐため、湿度の高い遮光箱または蓋付きのディッシュ/プレートに入れてください。

1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. PBSで各5分間、3回洗ってください。
   注意：Alexa Fluor^®蛍光色素で直接標識した一次抗体を用いる場合、ステップC8へ進んでください。
6. 検体に抗体希釈バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体*を加え、遮光して室温で1-2時間インキュベートしてください。
7. ステップ5と同様にPBSで洗ってください。
8. Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) with DAPI (#8961) を加え、カバーガラスで覆ってください。
9. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)、 F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

抗マウス

• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)、F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4410

抗ラット

• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L)、 (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418