免疫組織化学染色プロトコール (凍結組織切片)

A. 溶液および試薬

1. キシレン
2. エタノール (無水変性、病理学グレード 100%および95%)
3. ヘマトキシリン (オプション)
4. 固定液：最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください
   1. 10%中性緩衝ホルマリン
   2. アセトン
   3. メタノール
   4. 16%ホルムアルデヒド
      1. 3%ホルムアルデヒド：調製する場合は、16%ホルムアルデヒド18.75 mLを1X PBS 81.25 mLに加えてください。
5. 10X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、Trizma ​base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH₂O) 1Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。
6. 洗浄バッファー： 1X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLにを加えてください。
7. メタノール/ペルオキシダーゼ：30%過酸化水素水 (H₂O₂) 10 mLをメタノール90 mLに加えてください。-20℃で保存してください。
8. ブロッキング液： 1X TBS/0.3% Triton-X 100/5% Normal Goat Serum (#5425)。​調製する場合は、 1X TBS 9.5 mLに正常ヤギ血清 500 µLとTriton-X 100​ 30 µLを加えてください。
9. ビオチン標識二次抗体
10. ABC試薬： (Vectastain ABC Kit、Vector Laboratories, Inc.、Burlingame、CA)。メーカーの指示に従って、使用の30分前に調製してください。
11. DAB試薬または適切な基質： メーカーの推奨に従って調製してください。

B. 切片作製

1. -80℃で保存した組織の場合：切片を作製する前にフリーザーから取り出し、-20℃で約15分間平衡化してください。これにより切片作製時のブロックの亀裂を防ぐことができます。
2. 6​ - 8 µmの範囲で組織を薄切し、正に帯電したスライドに貼り付けてください。
3. 固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これによりスライドへ切片を接着させます)。

C. 固定

注意：最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。

1. スライド上で切片が乾いたことを確認し、下記の手順で最適な固定液で固定してください。
   1. 10%中性緩衝ホルマリン：室温で10分間。すぐに染色操作へ進んでください。
   2. 冷アセトン：-20°Cで10分間。その後風乾してください。すぐに染色操作へ進んでください。
   3. Methanol： -20°Cで10分間。すぐに染色操作へ進んでください。
   4. 3%ホルムアルデヒド：室温で15分間。すぐに染色操作へ進んでください。
   5. 3%ホルムアルデヒド/メタノール：3%ホルムアルデヒドに室温で15分間浸漬した後、メタノールに-20℃で5分間浸漬してください (この間に洗浄操作は不要です)。すぐに染色操作へ進んでください。

D. 染色

1. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
2. メタノールで希釈した3% H₂O₂で、室温で10分間インキュベートしてください。
3. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
4. ブロッキング液で各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
5. ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体100 - 400 µLを各切片に加えてください。(抗体希釈はブロッキング液で行ってください)。4℃で一晩インキュベートしてください。*製品のデータシート​で推奨希釈率を確認してください。
6. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
7. メーカーの推奨に従い、ブロッキング液で希釈した二次抗体100​-400 μLを各切片に加えてください。室温で30分間インキュベートしてください。
8. ABCアビジン/ビオチン法を使用する場合、メーカーの指示に従ってABC試薬を調製し、溶液を室温で30分間静置してください。
9. 二次抗体溶液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
10. ABC試薬100​ - 400 µLを各切片に加え、室温で30分間インキュベートしてください。
11. ABC試薬を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
12. DABまたは適切な基質 100​ - 400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
13. 切片の発色が進んだらすぐに、スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
14. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
15. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
16. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
17. カバーガラスで封入してください。