免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン)

*重要：適切な抗体希釈液と抗原賦活化の手順については、製品データシートを参照してください。IHCプロトコール： 賦活化バッファー/抗体希釈液。

A. 溶液および試薬

1. キシレン
2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
3. 精製水 (dH₂O)
4. ヘマトキシリン (オプション)
5. 洗浄バッファー：
   1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)： 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
   10X Tris Buffered Saline (TBS) 1 Lを調製する場合は、Trizma ​base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。
6. *抗体希釈液：
   1. SignalStain^® Antibody Diluent #8112
   2. TBST/5% Normal Goat Serum (#5425)： 1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 μLを加えてください。
   3. PBST/5% Normal Goat Serum (#5425)： 1X PBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 μLを加えてください。
      1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST)： 1 Lを調製する場合は、10X PBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
      10X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 1 Lを調製する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素二ナトリウム (Na₂HPO₄) 14.4 g、リン酸二水素カリウム (KH₂PO₄) 2.4 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
7. *抗原の賦活化：
   1. クエン酸： 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー：1 Lを調製する場合は、クエン酸三ナトリウム二水和物 (C₆H₅Na₃O₇•2H₂O) 2.94 gを、精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。pHを6.0に調整してください。
   2. EDTA： 1 mM EDTA：1 Lを調製する場合は、EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 0.372 gを精製水 (dH₂O) 1 Lに加えてください。pHを8.0に調整してください。
   3. TE： 10 mM Tris/1 mM EDTA、pH 9.0：1 Lを調製する場合は、Trizma base (C₄H₁₁NO₃) 1.21 gとEDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 0.372 gを、精製水 (dH₂O) 950 mLに加えてください。pHを9.0に調整し、精製水 (dH₂O) で全量を1000 mLにしてください。
   4. ペプシン： 1 mg/mLでTris-HCl pH 2.0​に溶解してください。
8. 3%過酸化水素水：調製する場合は、30% H₂O₂ 10​ mLを精製水 (dH₂O) 90 mLに加えてください。
9. ブロッキング液： TBST/5% Normal Goat Serum (#5425)：1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 µLを加えてください。
10. ビオチン化二次抗体
11. ABC試薬： (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)：使用の30分前に、メーカーの指示に従って調製してください。
12. DAB試薬または適切な基質： メーカーの推奨に従って調製してください。

B. 脱パラフィン/再水和

注意：操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

1. 切片の脱パラフィン/水和：
   1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
   2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
   3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
2. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C.*抗原の賦活化

注意：データシートを参照し、製品ごとの推奨賦活化液をご確認ください。

1. クエン酸の場合：10 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。
2. EDTAの場合：1 mM EDTA (pH 8.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、15分間沸騰直前の温度を維持してください。その後の冷却は必要ありません。
3. TEの場合： 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、18分間沸騰直前の温度を維持してください。室温で30分間冷却してください。
4. ペプシンの場合： 37°Cで10分間消化してください。

D. 染色

1. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
2. 3%過酸化水素水で切片を10分間インキュベートしてください。
3. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

注意：データシートを参照し、製品ごとの推奨抗体希釈液をご確認ください。

4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
5. ブロッキング液100-400 μLを加え、各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
6. ブロッキング液を除去し、推奨抗体希釈液で希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
7. 抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
8. メーカーの推奨に従い、TBSTで希釈したビオチン標識二次抗体100​-400 μLを各切片に加えてください。室温で30分間インキュベートしてください。
9. ABCアビジン/ビオチン方法を使用する場合、ABC試薬をメーカーの指定に従って調製し、溶液を30分間室温でインキュベートしてください。
10. 二次抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
11. 100-400μLのABC試薬を各切片に加え、30分間室温でインキュベートしてください。
12. ABC試薬を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
13. DABまたは適切な基質 100​ - 400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
14. 切片の発色が進んだらすぐに、スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
15. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
16. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
17. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
18. カバーガラスで封入してください。