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免疫組織化学染色プロトコール (パラフィン)

*重要:適切な抗体希釈液と抗原賦活化の手順については、製品データシートを参照してください。IHCプロトコール: 賦活化バッファー/抗体希釈液。

A. 溶液および試薬

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 精製水 (dH2O)
  4. ヘマトキシリン (オプション)
  5. 洗浄バッファー:
    1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST): 1 Lを調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
    10X Tris Buffered Saline (TBS): 1 Lを調製する場合は、Trizma®​base (C4H11NO3) 24.2 gと塩化ナトリウム (NaCl) 80 gを、精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。HClでpHを7.6に調整してください。
  6. *抗体希釈液:
    1. SignalStain® Antibody Diluent #8112
    2. TBST/5% Normal Goat Serum (#5425): 1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 μLを加えてください。
    3. PBST/5% Normal Goat Serum (#5425): 1X PBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 μLを加えてください。
      1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST): 1 Lを調製する場合は、10X PBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加えてください。Tween-20 ​1 mLを加え、混ぜ合わせてください。
      10X Phosphate Buffered Saline (PBS): 1 Lを調製する場合は、塩化ナトリウム (NaCl) 80 g、塩化カリウム (KCl) 2 g、リン酸水素二ナトリウム (Na2HPO4) 14.4 g、リン酸二水素カリウム (KH2PO4) 2.4 gを精製水 (dH2O) 1 Lに溶解してください。pHを7.4に調整してください。
  7. *抗原の賦活化:
    1. クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー:1 Lを調製する場合は、クエン酸三ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7•2H2O) 2.94 gを、精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。pHを6.0に調整してください。
    2. EDTA: 1 mM EDTA:1 Lを調製する場合は、EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを精製水 (dH2O) 1 Lに加えてください。pHを8.0に調整してください。
    3. TE: 10 mM Tris/1 mM EDTA、pH 9.0:1 Lを調製する場合は、Trizma®base (C4H11NO3) 1.21 gとEDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを、精製水 (dH2O) 950 mLに加えてください。pHを9.0に調整し、精製水 (dH2O) で全量を1000 mLにしてください。
    4. ペプシン: 1 mg/mLでTris-HCl pH 2.0​に溶解してください。
  8. 3%過酸化水素水:調製する場合は、30% H2O2 10​ mLを精製水 (dH2O) 90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液: TBST/5% Normal Goat Serum (#5425):1X TBST 5 mLにNormal Goat Serum 250 µLを加えてください。
  10. ビオチン化二次抗体
  11. ABC試薬: (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA):使用の30分前に、メーカーの指示に従って調製してください。
  12. DAB試薬または適切な基質: メーカーの推奨に従って調製してください。

B. 脱パラフィン/再水和

注意:操作の間は、スライドを乾燥さないようにご注意ください。

  1. 切片の脱パラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

C.*抗原の賦活化

注意:データシートを参照し、製品ごとの推奨賦活化液をご確認ください。

  1. クエン酸の場合:10 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。スライドを実験台で30分間冷却してください。
  2. EDTAの場合:1 mM EDTA (pH 8.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、15分間沸騰直前の温度を維持してください。その後の冷却は必要ありません。
  3. TEの場合: 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) にスライドを浸漬して沸騰させた後、18分間沸騰直前の温度を維持してください。室温で30分間冷却してください。
  4. ペプシンの場合: 37°Cで10分間消化してください。

D. 染色

  1. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、3回洗ってください。
  2. 3%過酸化水素水で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間、2回洗ってください。

注意:データシートを参照し、製品ごとの推奨抗体希釈液をご確認ください。

  1. 洗浄バッファーで切片を5分間洗ってください。
  2. ブロッキング液100-400 μLを加え、各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  3. ブロッキング液を除去し、推奨抗体希釈液で希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に加えてください。4℃で一晩インキュベートしてください。
  4. 抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間ずつ、3回洗ってください。
  5. メーカーの推奨に従い、TBSTで希釈したビオチン標識二次抗体100​-400 μLを各切片に加えてください。室温で30分間インキュベートしてください。
  6. ABCアビジン/ビオチン方法を使用する場合、ABC試薬をメーカーの指定に従って調製し、溶液を30分間室温でインキュベートしてください。
  7. 二次抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  8. 100-400μLのABC試薬を各切片に加え、30分間室温でインキュベートしてください。
  9. ABC試薬を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください。
  10. DABまたは適切な基質 100​-400 µLを各切片に加え、発色を注意深く観察してください。
  11. 切片の発色が進んだらすぐに、スライドを精製水 (dH2O) に浸してください。
  12. 必要に応じて、メーカーの指示に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  13. 精製水 (dH2O) で切片を各5分間ずつ、2回洗ってください。
  14. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間ずつ、2回インキュベートしてください。
  15. カバーガラスで封入してください。

更新:2005年6月

改訂日:2008年2月

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