免疫沈降プロトコール (キナーゼアッセイ)

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
2. 1X Cell Lysis Buffer： 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM Sodium pyrophosphate、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na₃VO₄、1 μg/mL Leupeptin。Cell Lysis Buffer (10X) (#9803)。

注意：使用直前に1 mM PMSFを加えてください。

1. Protein A Agarose Beads： (#9863) 5 mlの1X PBSを1.5 gのProtein A Agarose Beadsに加えてください。4°Cで2時間振盪した後、14,000​ x gで1分間遠心分離してペレット化してください。ペレットをPBSで2回洗ってください。等量のPBSでビーズを再懸濁してください (50%スラリー)。
2. 1X Kinase Buffer： 25 mM Tris (pH 7.5), 5 mM β-グリセロリン酸、2 mM DTT、0.1 mM Na₃VO₄、10 mM MgCl₂

B. 細胞ライセートの調製

1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 未変性状態で細胞を回収する場合、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回洗ってください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) 当たり氷冷した1X Cell Lysis Bufferを0.5 mL加え、氷上でプレートを5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
5. 氷上で各5​秒間、3回超音波処理を行ってください。
6. 14,000 x g、4°Cで10分間遠心分離して、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは–80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

注意：固相化した一次抗体を用いた免疫沈降の場合：固相化抗体ビーズスラリー20 μLを細胞ライセート200 μLに加えてください。静かに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。ステップ3の洗浄に進んでください。

1. 細胞ライセート200 μLに一次抗体を加えて、4°Cで一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートしてください。
2. Protein A agarose beads (50%ビーズスラリー20 μL) を加えてください。静かに振盪しながら4°Cで1-3時間インキュベートしてください。
3. 4°Cで30秒間、遠心してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 μLで2回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
4. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。

D.キナーゼアッセイ

1. ペレットを200 µM ATPと基質を添加した1X Kinase Buffer 40 μLに懸濁してください。
2. 30°Cで 30分間インキュベートしてください。
3. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させてください。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
4. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱してください。
5. サンプル (15-30 μL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。
6. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールを参照してください)。