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フローサイトメトリー (核透過化染色)

次の製品の専用プロトコールです： PCNA (PC10) Mouse mAb #2586

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  1. 1X Phospate Buffered Saline (PBS)： NaCl ​8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4​ ​ 1.44 g、KH2PO​4​ ​ 0.24 gを、精製水 (dH2​O) 800 mLに溶解してください。HClを用いてpHを7.4​​に調整し、精製水を加えて全量を1 Lにしてください。室温で保存してください。
  2. 無水メタノール
  3. インキュベーションバッファー： ウシ血清アルブミン (BSA) 0.5 gを1X PBS 100 mLに溶解してください。4℃で保存してください。
  4. 透過化バッファー： 0.5% Triton X-100、0.2 µg/mL EDTA、1% BSAを含むPBS

A. 細胞の単離および固定

  1. 遠心分離で細胞を集め、上清を吸引してください。
  2. 細胞をPBS 100 μLに軽く再懸濁してください。
  3. 透過化バッファー500 μLを加えてください。氷上で15分間インキュベートしてください。
  4. 氷冷した100%メタノール3 mLを加えて、時々混ぜ合わせながら10分間インキュベートしてください。
  5. 染色に進むか、または細胞を-20°Cで保存してください。

B. 免疫染色

注意：モノクローナル抗体にはアイソタイプを一致させたコントロールを、ポリクローナル抗体には免疫動物種を一致させたIgGコントロールを使用することを推奨します。細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

  1. ​​​0.5​-1 x 106個の細胞をアッセイチューブに分注してください。
  2. インキュベーションバッファー2​-3 mLを各チューブに加えて洗浄し、遠心分離で細胞を集めてください。繰り返す。
  3. アッセイチューブごとに、インキュベーションバッファー100 μLで細胞を再懸濁してください。
  4. 室温で10分間、インキュベーションバッファーでブロッキングしてください。
  5. 適切に希釈された未標識の一次抗体、ビオチン標識一次抗体、または蛍光標識一次抗体をアッセイチューブに加えてください (推奨希釈率については抗体のデータシートを参照してください)。
  6. 室温で1時間インキュベートしてください。
  7. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
  8. 蛍光色素で標識した一次抗体を用いる場合は、細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。未標識一次抗体やビオチン化一次抗体を用いる場合はステップD9に進んでください。
  9. インキュベーションバッファーで推奨倍率に従って希釈した蛍光標識二次抗体*、または蛍光標識アビジンで、細胞を再懸濁してください。
  10. 室温で30分間インキュベートしてください。
  11. 前のステップと同様に、インキュベーションバッファーを加えて洗浄し、遠心分離にで細胞を集めてください。
  12. 細胞をPBS 0.5 mLで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。もしくは、DNA染色のため、ステップC1に進んでください。

C. DNA染色 (オプション)

  1. 細胞をDNA染色色素0.5 mLに再懸濁してください (例：Propidium Iodide (PI) / RNase Staining Solution #4087​)。
  2. 少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。

DNA染色された細胞をフローサイトメーターで解析してください。

*推奨二次抗体:

抗ウサギ

抗マウス

抗ラット

更新：2012年4月

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