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PathScan® Sandwich ELISAプロトコール (比色ELISA)

注意：アッセイのインキュベーション温度については製品のデータシートまたは製品ウェブページを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808) 1 LのPBSを調製する場合：10X PBS 50 mLと精製水 (dH2O) 950 mLを混ぜ合わせてください。
  2. 使用前に、全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
  3. PathScan® Sandwich ELISAキットに含まれる20X Wash BufferをdH2Oで希釈し、1X Wash Bufferを調製してください。

  4. 1X Cell Lysis Buffer​：10X Cell Lysis Buffer (#9803)：1X Cell Lysis Buffer 10 mLを調製するために、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mLに加えて混ぜ合わせてください。PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer (#7018) 1X：このバッファーは、ready to useです。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

    推奨​：1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (#8553) を使用直前に加えてください。

    注意：溶解バッファーの推奨については、製品のデータシートまたはウェブページを参照してください。

  5. TMB基質​：(#7004)
  6. STOP溶液​：(#7002)

B. 細胞ライセートの調製

接着細胞の場合

  1. 密度が​80​-90%コンフルエントの細胞を用意し、培地を吸引除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 細胞を氷冷した1X PBSで1回洗浄してください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm径) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. 細胞をプレートから掻き取り、適切なチューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  6. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

  1. 解析対象となる細胞を増殖させ、生細胞密度が0.5​-1.0 x 106細胞/mLに達したら、低速遠心分離 (~1,200 rpm) で細胞を集め、培地を除去してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 低速遠心分離 (~1,200 rpm) により細胞を回収し、5​-10 mLの氷冷した1X PBSで1回洗ってください。
  3. 増殖培地50 mLから回収した細胞を、1X Cell Lysis Buffer + 1 mM PMSF混合液2.0 mLで溶解してください。
  4. ライセートを氷上で超音波処理 (ソニケーション) してください。
  5. 4°Cで10分間遠心分離 (x14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。1回分ずつに分注し、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

  1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要な数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーにセットしてください。未使用のマイクロウェルは、保存バッグ中に再度密封して直ちに4°Cで保存してください。
  2. 細胞ライセートは、そのまま、あるいは各PathScan® ​Sandwich ELISA キットに含まれてる青色のサンプル希釈液により希釈して、使用してください。ライセートの適切な希釈率とアッセイ結果に関する情報は、各キットのデータシートあるいは製品のウェブページに記載されています。
  3. 適切なウェルに、未希釈、あるいは希釈した各細胞ライセート100 μLを加えてください。テープで密封し、マイクロウェルの上からきつく押し付けてください。プレートを37°Cで2時間インキュベートしてください。あるいは、プレートを4°Cで一晩インキュベートすることも可能です。
  4. ​静かにテープを取り除き、ウェルを洗ってください:
    1. 廃棄容器にプレートの内容物を捨ててください。
    2. 各ウェルを1X Wash Buffer 200​ μLで、4回洗ってください。
    3. 各洗いの操作で、各ウェルに残った液を除去するために、十分な強さでプレートを新しいペーパータオルに叩きつけてください。ただし、常にウェルを乾燥させないようにしてください。
    4. 糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。
  5. 各ウェルに、検出抗体 (緑色) 100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37°Cで1時間インキュベートしてください。
  6. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
  7. HRP標識二次抗体 (赤色) 100 μLを各ウェルに加えてください。テープで密封し、プレートを37°Cで30分間インキュベートしてください。
  8. 洗いの操作を繰り返してください (セクションC、ステップ4)。
  9. TMB基質100 μLを各ウェルに加えてください。テープで密封してプレートを37°Cで10分間インキュベートするか、または25°Cで30分間インキュベートしてください。

  10. STOP溶液100 μLを各ウェルに加えてください。数秒間静かに振盪してください。

    注意：陽性反応の最初の色は青色です。STOP溶液を加えることにより黄色に変わります。

  11. 結果を測定してください。
    1. ​目視による呈色の判定​：STOP溶液を加えてから30分以内に結果を判定してください。
    2. ​吸光度測定​：糸くずの出ないティッシュ (キムワイプ) で全てのウェルの裏側を拭いてください。STOP溶液を加えてから30分以内に450 nmの吸光度を測定してください。

更新：2005年6月

改訂日：2013年11月

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