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ウェスタンブロッティングプロトコール (BSAで一次抗体反応を行う場合)

本プロトコールでは、BSAを含む抗体希釈液 (5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween-20) で一次抗体反応液を調製し、反応液中で転写膜を緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてウェスタンブロットを行います。

カタログ番号をクリックするとCell Signaling Technology (CST) 製品の情報をご覧いただけます。

A. 溶液および試薬

注意:Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
  2. 1X SDS Sample Buffer: (#7722​、#7723) 62.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、2% w/v SDS、10%グリセロール、50 mM DTT、0.01% w/v bromophenol blueまたはphenol red
  3. 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
  4. 10X Tris Buffered Saline (TBS): (#9997) 10X TBSを1 L調製する場合は、Tris base ​24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、HClでpHを7.6に調節してください (1X で使用)
  5. 脱脂粉乳 (#9999)
  6. ブロッキングバッファー:5%脱脂粉乳を添加した、0.1% w/v Tween-20含有1X TBS:150 mLを調製する場合、10X TBS 15 mLを水135 mLに加えて撹拌してください。脱脂粉乳7.5 gを加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。撹拌しながらTween-20 (100%) を0.15 mL加えてください。
  7. 洗浄バッファー:0.1% Tween-20含有1X TBS (TBS/T)
  8. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  9. 一次抗体希釈バッファー: 5% BSA含有1X TBS、0.1% Tween-20。20 mLを調製する場合は、10X TBS 2 mLを精製水18 mLに加え、混ぜ合わせてください。1.0 gのBSAを加えてよく混ぜ合わせてください。撹拌しながらTween-20 (100%) を20 μL加えてください。
  10. Phototope®-HRP Western Blot Detection System (anti-rabbit:​#7071​、anti-mouse:​#7072) 本製品はBiotinylated Protein Ladder (#7727)、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 標識した二次抗体 (anti-rabbit:​#7074​、anti-mouse:#7076)、anti-biotin HRP-linked antibody (#7075)、chemiluminescent reagent and peroxide (#7003)、LumiGLO®​ chemiluminescent reagent and peroxide (#7003) を含みます。
  11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) (#7720)
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack: (#7727)
  13. 転写膜:このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています (CST推奨)。PVDF転写膜も使用できます。

B. タンパク質のブロッティング

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmのプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm x 10 cm) に20 µLアプライし、電気泳動してください。注意:CSTは、電気泳動および転写の確認のためにプレステイン分子量マーカー (#7720、10 μL/レーン) を、分子量の決定のためにビオチン化プロテインラダー (#7727、10 μL/レーン) を同時に電気泳動することをお勧めしています。
  8. ニトロセルロース膜またはPVDF膜に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm × 10 cm (100 cm2) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

  1. オプション:転写後、ニトロセルロース膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。
  4. 一次抗体10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

I.非標識一次抗体の場合

  1. 適切なHRP標識二次抗体 (2000​倍希釈、一次抗体の検出) およびHRP標識ビオチン抗体 (1000​倍希釈、ビオチン標識プロテインラダーの検出) を含むブロッキングバッファー10​ mL中で、転写膜を穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。
  2. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

II. HRP標識一次抗体の場合

タンパク質の検出 (ステップD) に進んでください。

III. ビオチン標識一次抗体の場合

  1. HRP標識ストレプトアビジン (適切な希釈率に希釈して使用してください) を含む脱脂粉乳液中で、転写膜を穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。
  2. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

D. タンパク質の検出

  1. 転写膜をLumiGLO​® 10 mL (20X LumiGLO​® 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mL、Milli-Q水 9.0 mL を混ぜ合わせてください) 中で、穏やかに振盪しながら室温で1分間インキュベートしてください。注意:反応が速すぎる場合は、LumiGLO®基質をさらに希釈して使用してください。
  2. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初めに10秒間の露光をして、適度な露光時間を予測することができます。注意:検出反応の速度論に従い、シグナルはLumiGLO®インキュベーション開始直後が最も強く、2時間かけて減退します。

更新:2005年6月

改訂日:2008年10月

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