ウェスタンブロッティングプロトコール (未変性IgG特異的二次抗体/軽鎖特異的二次抗体/抗ビオチン二次抗体)

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAあるいは脱脂粉乳、0.1% Tween-20​を含む1X TBSを使用してください。

注意：製品データシートを参照し、一次抗体の推奨希釈率と希釈バッファーをご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意：Milli-Qまたは同等の精製水で溶液を調製してください。

1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808) 1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dHO) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
2. 1X SDS Sample Buffer： (#7722​、#7723) 62.5 mM Tris-HCl (25°CでpH 6.8)、2% w/v SDS、10%グリセロール、50 mM DTT、0.01% w/v bromophenol blueまたはphenol red
3. 転写バッファー： 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
4. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： (#9997) 10X TBSを1 L調製する場合は、Tris base ​24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、HClでpHを7.6に調節してください (1X で使用)
5. 脱脂粉乳 (#9999)
6. ブロッキングバッファー：5%脱脂粉乳を添加した、0.1% w/v Tween-20含有1X TBS：150 mLを調製する場合、10X TBS 15 mLを水135 mLに加えて撹拌してください。脱脂粉乳7.5 gを加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。撹拌しながらTween-20 (100%) を0.15 mL加えてください。
7. 洗浄バッファー：0.1% Tween-20含有1X TBS (TBS/T)
8. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
9. 一次抗体希釈バッファー： 一次抗体の製品データシートに記載に従い、5% BSAまたは5%脱脂粉乳を含むTBST (0.1% Tween-20​を含む1XTBS) を調製してください。20 mL調製する場合、10X TBS 2 mLを18 mLの精製水に加えて混ぜ合わせてください。BSA​​​もしくは​脱脂粉乳​1.0 gを加えてよく攪拌してください。撹拌しながらTween-20 (100%) を20 μL加えてください。
10. Phototope^®-HRP Western Blot Detection System (​anti-rabbit：​#7071​​、anti-mouse：​#7072​)：本製品は、Biotinylated Protein Ladder (#7727)、 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 標識二次抗体 (anti-rabbit：#7074​、anti-mouse：#7076)、anti-biotin HRP-linked antibody (#7075)、LumiGLO^®​chemiluminescent reagent and peroxide (#7003) を含みます。
11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) (#7720)
12. 転写膜：このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています (CST推奨)。PVDF転写膜も使用できます。

B. タンパク質のブロッティング

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmのプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
6. 5分間遠心分離してください。
7. SDS-PAGEゲル (10 cm x 10 cm) に20 µLアプライし、電気泳動してください。注意：CSTは、電気泳動および転写の確認のためにプレステイン分子量マーカー (#7720、10 μL/レーン) を、分子量の決定のためにビオチン化プロテインラダー (#7727、10 μL/レーン) を同時に電気泳動することをお勧めしています。
8. ニトロセルロース膜またはPVDF膜に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：10 cm × 10 cm (100 cm²) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

1. オプション：転写後、ニトロセルロース膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
3. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

1. 一次抗体10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
2. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。
3. ブロッキングバッファーで2000倍希釈したMouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) または Mouse anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)、あるいはブロッキングバッファーで1000倍希釈した Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb (#5597) を10 mL調製し、転写膜をこの中で静かに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。
4. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。

5. Mouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677​および
   Mouse anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678の場合：

   ビオチン標識プロテインマーカーを検出するため、ブロッキングバッファー10 mLに Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (#7076、2000倍希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1000倍希釈) を加え、転写膜を静かに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。

   Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb #5597の場合：

   ブロッキングバッファーで2000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, HRP-linked antibody (#7074) 10 mL中で、転写膜を静かに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。

6. TBS/T 15 mLで5分間、3回洗ってください。
7. セクションDの検出ステップへ進んでください。

D. タンパク質の検出

1. 転写膜をLumiGLO^​®​ 10 mL (20X LumiGLO​^®​ 0.5 mL、20X Peroxide 0.5 mLをMilli-Q水 9.0 mLに加えて混ぜ合わせてください) 中で、穏やかに振盪しながら室温で1分間インキュベートしてください。　注意：反応が速すぎる場合は、LumiGLO^®基質をさらに希釈して使用してください。
2. 転写膜の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線フィルムに露光してください。初めに10秒間の露光をして、適度な露光時間を予測することができます。注意：検出反応の速度論に従い、シグナルはLumiGLO^®インキュベーション開始直後が最も強く、2時間かけて減退します。