Render Target: STATIC
Render Timestamp:
6/4/2026, 5:49:52 AM EDT
6/4/2026, 9:49:52 AM UTC
Commit: 33ae406c5df2bbc7a7d3c17605228fbeff8ea416
Cell Signaling Technologyロゴ - Extra Large
注目情報を見る >>
1% for the planet logo
  1. ホーム /
  2. 学術情報 & サポート /
  3. プロトコール /
  4. Leica Biosystems社のBOND RX全自動免疫染色装置用のSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色アッセイ

Leica Biosystems社のBOND RX全自動免疫染色装置用のSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色アッセイ

製品情報：

signalstar-8plex  

保存：キットのすべての構成品を-20°Cで保存してください。

安定性：キットのすべての構成品は、推奨された温度で保存した場合、少なくとも12か月間安定性を維持します。5回を超える凍結/解凍サイクルは、行わないでください。

適用：SignalStarキットは、蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色を行う際にご使用いただけます。

スライド数：このキットには、10枚のスライドの染色に必要な材料が含まれています。
SignalStar Symbols

目次

1 はじめに：SignalStar™染色の方法論

SignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) は、抗体、オリゴヌクレオチド (オリゴ)、蛍光色素を用いて標的の細胞内での存在や局在、機能、バイオマーカーとの共発現パターンを調査するための技術です。SignalStar技術は、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。

SignalStarシステムの能力の源は、SignalStarに用いる抗体のデザインに存在します。これらの抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織で用いるために厳密に検証されており、その後、部位特異的な標識と徹底した精製法を用いて各オリゴヌクレオチド (オリゴ) タグに結合させます。高度に特異的な、相補的オリゴのネットワークと蛍光色素を用いることにより、科学者は、存在量が低いものも含めて3-8種類の標的のシグナルを増幅できます。

SignalStar Multiplex IHC WorkFlow Diagram

図1. ご希望のプレックスサイズ (最大3-8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体のカクテルを、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加してください。蛍光色素標識済みの相補的オリゴ (チャンネル：488、594、647、750) を用いて、オリゴ-蛍光色素のコンストラクトを構築して抗体に結合させることにより、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルが増幅できます。プレックスのサイズが4より大きい場合は、1ラウンド目のオリゴと蛍光色素を穏やかに除去し、2ラウンド目で、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体を可視化するための増幅を行います。この相補的なオリゴシステムと蛍光色素の除去プロセスにより、交差反応を示すことなく、同じ基質を用いて2ラウンド目の抗体シグナルを増幅できます。その後、2つの画像を、専用またはオープンソースのソフトウェアを用いてコンピューター上で位置合わせして結合し、最大8種類の標的を含む画像を作成します。

2 溶液および試薬

2.1 キットに含まれる構成品

キットに含まれる構成品
最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (以下を参照)
最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Amplification Oligo Set A：
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Amplification Oligo Set B：
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Ligation Buffer
T4 DNA Ligase (5 U/µL)
ATP (100 mM)
10X dsDNase Buffer
dsDNase
 

キットには、ご注文時にお選びいただいた最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (A) および最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (B) が含まれており、これらはオリゴ-抗体ペア (C) として共に梱包されています。以下の例を参照してください。

SignalStar Oligo Antibodies

2.2 キットに含まれない必要な試薬

  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10%中性緩衝ホルマリン液
  • 低吸着ピペットチップ

2.3 キットに含まれない必要な試薬 (Leica Biosystems社から入手可能)

  • BOND Research Detection System #DS9455
  • BOND Aspirating Probe Cleaning Kit #CS9100
  • BOND Titration Kit (10 containers, 50 inserts) #OPT9049
  • BOND Open Containers 30 mL (10 pack) #OP309700
  • BOND Open Containers 7 mL (10 pack) #OP79193
  • BOND Universal Covertiles (160 pack) #S21.4611
  • BOND TM Epitope Retrieval 2-1 L (RTU) #AR9640
  • BOND Dewax Solution 1 L (RTU) #AR9222
  • BOND Wash Solution 10X Concentrate, 1L #AR9590

3 開始前の重要な考慮事項

Warning

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。
 
Warning

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。
Caution

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。新しいBOND Research Detectionシステム用のコンテナやプロトコールを設定してください。ここに記載のプロトコールの実行には、BOND Research Detectionシステムが必要です。
Caution

SignalStarアッセイの各ラウンドが完了したら、毎回BOND RXの吸引プローブの洗浄を行ってください。
Caution

SignalStarパネルデザインで、2ラウンドのイメージングが必要か否かを確認してください。このページのセクション10.1および9.1にあるSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
Caution

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。イメージングの際に、DAPIに加えて4種類の蛍光チャンネルが必要となります。
 
蛍光チャンネル 励起波長 (nm) 放射波長 (nm) レーザー線 一般的なフィルターセット
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
Note

単染色したスライドを上記のスペクトルでイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、スペクトルの分離が可能になります。
Note

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。明るいDAPI染色により、画像の位置合わせが行いやすくなります。
Caution

溶液が十分に攪拌されていない場合、蛍光シグナルが変化する、または消失する可能性があります。使用前に、各試薬を1,000 rpmで30秒間遠心し、その後、ゆっくりとピペッティングで混合してください。試薬を使用する際は、正確性を確保するためにピペット操作をゆっくりと行ってください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
Caution

可能な限り、染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。
Note

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。SignalStarプロトコールは、指定された抗原賦活化と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。
Note

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。
Note

各抗体を1:100で使用することを推奨します。ただし、1:50または1:200のどちらの希釈率で使用した場合でも十分な量の抗体試薬を提供しています。

4 BOND RX全自動免疫染色装置の設定

Caution

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。BOND RXソフトウェアバージョン7.0以上が必要です。

4.1 BOND RX全自動免疫染色装置上での新たな試薬の調製

以下の試薬は、SignalStarアッセイ用にBOND RXで作成する必要があります。

BONDタイトレーションコンテナ

 

1. MARKER (= SignalStar Staining Solution)
 

2. SignalStar Amplification Solution 1
 

3. SignalStar Amplification Solution 2
 

4. SignalStar Ligation Solution
 

5. SignalStar Fluorescent Removal Solution

BOND 7 mLオープンコンテナ

 

6. 10%中性緩衝ホルマリン液
Caution

10%中性緩衝ホルマリン液を作製する際は、「Hazardous」を選択し、廃液が適切に廃棄されることを確認してください。

BOND 30 mLオープンコンテナ

 

7. 0.1X TBST
 

8. 1X TBST (BOND Research Detectionシステムへの連結に必要です)

4.2 BOND Research Detectionシステムの設定

 

1. 「CST SignalStar」と名付けた新しいBOND Research Detectionシステムを作成してください。
 

2. 1X TBSTを含む30 mLオープンコンテナを、CST SignalStar BOND Research Detectionシステムに連結してください。
Caution

ステップ2のオープンコンテナには明確な名称をつけてください (例えば「0.1X TBST」ではな「1X TBST」)。

4.3 SignalStarイメージングラウンド1およびイメージングラウンド2用のBOND RXプロトコールの作成

 

1. BOND RXソフトウェアで、「Protocol Setup」を選択してください。
 

2. 「*IF Protocol」を選択してください。(「Modified by」カラムにLeicaが表示されていることを確認してください。)
 

3. プロトコールをコピーして作成し、「CST SignalStar Imaging Round 1」に名称を変更してください。省略名の「CST Rd1」を追加してください。
 

4. 「Show wash steps」を選択してください。
 
5. 
 		 すべてのステップを削除し、この文書の「BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1」というタイトルのセクション9.2に記載されているステップを加えてください。

 
 

6. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。
 

7. 「Create Protocol」を選択してください。
 

8. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。
 

9. 「CST SignalStar Imaging Round 1」プロトコールのコピーを作成してください。
 

10. コピーのファイル名を「CST SignalStarイメージングラウンド2」に変更し、省略名「CST Rd2」を追加してください。
 

11. 「Show wash steps」を選択してください。
 
12. 
 		 ステップ1-11を削除し、本書「BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド」のセクション9.3に記載されているステップ1-10を追加してください。
 

13. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。
 

14. 「Create Protocol」を選択してください。
 

15. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。

5 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製

Warning

アッセイを正しく実行するために、各試薬は適切なBOND RXコンテナ中か、BOND Titration Kit (#OPT9049) のインサート中で使用する必要があります。BOND RX全自動免疫染色装置でSignalStarアッセイを行うために必要なコンテナまたはインサートの数は下表をご覧ください。
Warning

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX全自動免疫染色装置では、コンテナが過充填されていると"Empty"とみなされます。
 

試薬
BONDコンテナ		 必要なコンテナの数
5スライド 10スライド
SignalStar Imaging Round 1 Solution BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 1
SignalStar Amplification Solution 1 BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 2
SignalStar Amplification Solution 2 BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 2
SignalStar Ligation Solution BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 1
10%中性緩衝ホルマリン液 BOND 7 mLオープンコンテナ 1 1
0.1X TBST Solution BOND 30 mLオープンコンテナ 2 3
1X TBST Solution BOND 30 mLオープンコンテナ 1 1

5.1 イメージングラウンド1：SignalStar Solution

Caution

調製後のSignalStar Imaging Round 1 Solutionには、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大8種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページのセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
Warning

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。
Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサート中ではゆっくりとピペッティングしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。すべての試薬を混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 770 1,295
SignalStar Antibody Diluent B 330 555
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 1 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 2 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 3 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 4 (必要に応じて) 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 5 (必要に応じて) 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 6 (必要に応じて) 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 7 (必要に応じて) 11 18.5
SignalStar Oligo-Conjugated Antibody 8 (必要に応じて) 11 18.5
イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo 1 11 18.5
イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo 2 11 18.5
イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo 3 11 18.5
イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo 4 (必要に応じて) 11 18.5
総量 1,232 2,072

5.2 イメージングラウンド1：SignalStar Amplification Solution 1

Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサート中ではゆっくりとピペッティングしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
Caution

10スライドを実行する際は、まずコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサート間で均等になるように分注してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750 48.5 93.5
総量 5,044 9,724

5.3 イメージングラウンド1：SignalStar Amplification Solution 2

Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサート中ではゆっくりとピペッティングしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
Caution

10スライドを実行する際は、まずコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサート間で均等になるように分注してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750 48.5 93.5
総量 5,044 9,724

5.4 イメージングラウンド1：SignalStar Ligation Solution

Caution

以下の試薬を、1つのBONDタイトレーションインサート中で混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
総量 1,100 1,850

5.5 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

 
  • 0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、5 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH2Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドあたり2コンテナ、10スライドあたり3コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生に注意してください。
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、50 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH2Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生に注意してください。
  • 10%中性緩衝ホルマリン液：研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

6 SignalStarイメージングラウンド1：BOND RXプロトコール

6.1 スライドベーキング

Note

スライドベーキングは、実験開始の前日に行うことができます。このステップで、パラフィンワックスを融解させます。
  1. スライドを60°Cで30分間インキュベートしてください。

6.2 BOND RXプロトコールの実行

  2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
  3. 「Adding slides」から、BOND上での組織の調製用に以下を選択してください。
  1. Slide preparation: Dewax
  2. Dispense Volume:150 µL
  3. HIER: ER2 40 min
  4. スライドごとにプロトコール欄で"SignalStar Imaging Round 1"と"HIER ER2 40 min"を選択してください。
  5. ラベルを印刷してスライドに貼り、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
  6. BONDカバータイルをスライド上に置き、トレーの適切な位置に設置されていることを確認してください。
Caution

SignalStar Imaging Round 1プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション9.2に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
Caution

以下の各0.1X TBST洗浄ステップが"Open"にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが「Open」でない場合には、蛍光シグナルが変化または減弱する可能性があります。SignalStar Amplification Solution 1が6ステップ、SignalStar Amplification Solution 2が6ステップあることを確認してください。
Caution

bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
  7. BOND RXを実行してください。
Warning

速やかにBOND RX染色を実行してください。遅延スタートは使用しないでください。染色完了後、スライドをBOND RX全自動免疫染色装置上に一晩置いておくことができます。
  8. BOND RX全自動免疫染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
  9. BOND RX全自動免疫染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。通常の手順に従ってカバータイルを洗浄してください。
  10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
  11. DAPI溶液で対比染色してください。
  12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
  13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
  14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。
Caution

脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外した後は、いかなる時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。

7 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製

Warning

アッセイを正しく実行するために、各試薬は適切なBOND RXコンテナ中か、BOND Titration Kit (#OPT9049) のインサート中で使用する必要があります。BOND RX全自動免疫染色装置でSignalStarアッセイを行うために必要なコンテナまたはインサートの数は下表をご覧ください。
Warning

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX全自動免疫染色装置では、コンテナが過充填されていると"Empty"とみなされます。
 

試薬
BONDコンテナ		 必要なコンテナの数
5スライド 10スライド
SignalStar Imaging Round 2 Solution BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 1
SignalStar Amplification Solution 1 BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 2
SignalStar Amplification Solution 2 BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 2
SignalStar Ligation Solution BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 1
10%中性緩衝ホルマリン液 BOND 7 mLオープンコンテナ 1 1
0.1X TBST Solution BOND 30 mLオープンコンテナ 2 3
1X TBST Solution BOND 30 mLオープンコンテナ 1 1
SignalStar Fluorescent Removal Solution BOND 6 mLタイトレーションインサート 1 1

7.1 イメージングラウンド2：SignalStar Solution

Caution

調製後のSignalStar Imaging Round 2 Solutionは、イメージングラウンド2用の相補的オリゴを含んでいる必要があります。このページのセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
Warning

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。
Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサート中ではゆっくりとピペッティングしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。SignalStar溶液は、目的の実験用の試薬をすべて混合したら速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 770 1,295
SignalStar Antibody Diluent B 330 555
イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo 5 11 18.5
イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo 6 (必要に応じて) 11 18.5
イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo 7 (必要に応じて) 11 18.5
イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo 8 (必要に応じて) 11 18.5
総量 1,144 1,924

7.2 イメージングラウンド2：SignalStar Amplification Solution 1

Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサート中ではゆっくりとピペッティングしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
Caution

10スライドを実行する際は、まずコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサート間で均等になるように分注してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750 48.5 93.5
総量 5,044 9,724

7.3 イメージングラウンド2：SignalStar Amplification Solution 2

Caution

低吸着ピペットチップを用いて溶液を調製し、室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。正確性を確保し、気泡の発生を防ぐために、BOND 6 mLタイトレーションインサートにゆっくりとピペットで分注してください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
Caution

10スライドを実行する際は、まずコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサート間で均等になるように分注してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 2,425 4,675
SignalStar Amplification Buffer B 2,425 4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647 48.5 93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750 48.5 93.5
総量 5,044 9,724

7.4 イメージングラウンド2：SignalStar Ligation Solution

Caution

1つのBONDタイトレーションインサート中で以下の試薬を混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。目的の実験用の試薬をすべて混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer 550 925
Nuclease-free Water #12931 517 869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL) 22 37
ATP (100 mM) 11 18.5
総量 1,100 1,850

7.5 イメージングラウンド2：SignalStar Fluorescent Removal Solution

Caution

1つのBONDタイトレーションインサート中で以下の試薬を混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。SignalStar溶液は、目的の実験用の試薬をすべて混合したら速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
10X dsDNase Buffer 185 335
dsDNase 18.5 33.5
Nuclease-free Water #12931 1,646.5 2,981.5
総量 1,850 3,350

7.6 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

 
  • 0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、5 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH2Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドあたり2コンテナ、10スライドあたり3コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生に注意してください。
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、50 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH2Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生に注意してください。
  • 10%中性緩衝ホルマリン液：研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

8 SignalStarイメージングラウンド2：BOND RXプロトコール

  1. SignalStarイメージングラウンド1のイメージング後に、スライドをdH2O中に>30分間浸してからカバーガラスを穏やかに除去してください。
Caution

脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外した後は、いかなる時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。
  2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
  3. 「Adding slides」から、BOND上での組織の調製用に、以下を選択してください。
  1. Slide preparation:-- (no value/not required)
  2. Dispense Volume:150 µL
  3. HIER:-- (no value/not required)
  4. 「CST SignalStar Imaging Round 2」を選択し、Slide preparationで「--」、HIERで「--」が選択されていることを確認してください。
  5. ラベルを印刷してスライドに貼って、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
  6. BONDカバータイルをのせる前に、2-3滴のdH2Oを各スライド上に添加してください。
Warning

重要：DewaxおよびHIER (抗原賦活化) は、増幅ラウンド2には必要ありません。DewaxおよびHIERを行った場合、増幅ラウンド2の結果が解釈不能になります。
Caution

Imaging Round 2プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション9.3に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
Caution

以下の各0.1X TBST洗浄ステップが"Open"にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが"Open"でない場合には、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStar Amplification Solution 1が6ステップ、SignalStar Amplification Solution 2が6ステップあることを確認してください。
Caution

bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
  7. BOND RXを実行してください。
Warning

速やかにBOND RX染色を実行してください。遅延スタートは使用しないでください。染色完了後、スライドをBOND RX全自動免疫染色装置上に一晩置いておくことができます。
  8. BOND RX全自動免疫染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
  9. BOND RX全自動免疫染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。毎回、カバータイルを洗浄してください。
  10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
  11. DAPI溶液で対比染色してください。
  12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
  13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
  14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。
Caution

脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外した後は、いかなる時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。

9 ユーザーワークシート

9.1 SignalStarパネルデザインワークシート

オリゴ標識抗体 相補的オリゴ 製品ペア＃ イメージングラウンド 488 594 647 750
               
               
               
               
               
               
               
               

(Appendix10.1のパネルデザインの例をご覧ください。)

9.2 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1

BONDステップ ✓ 試薬 ステップの種類 インキュベーション時間 (分) 温度 (℃) 分注タイプ
1 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 150 µL
2 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
3 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 150 µL
4 □ 0.1X TBST Solution 洗浄 0:00 室温 150 µL
5 □ MARKER (SignalStar Imaging Round 1 Solution) 一次 40:00 室温 150 µL
6 □ 1X TBST Solution 試薬 5:00 室温 オープン
7 □ 0.1X TBST Solution 試薬 5:00 室温 150 µL
8 □ 10%中性緩衝ホルマリン液 試薬 5:00 室温 150 µL
9 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
10 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
11 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 150 µL
12 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
13 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
14 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
15 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
16 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
17 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
18 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
19 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
20 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
21 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
22 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
23 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
24 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
25 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
26 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
27 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
28 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
29 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
30 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
31 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
32 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
33 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
34 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
35 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
36 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
37 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
38 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
39 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
40 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
41 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
42 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
43 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
44 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
45 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
46 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
47 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
48 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
49 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
50 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
51 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
52 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
53 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
54 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
55 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
56 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
57 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
58 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
59 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
60 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
61 □ SignalStar Ligation Solution 試薬 20:00 室温 150µL
62 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
63 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
64 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
65 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
66 □ BOND Wash Solution 洗浄 0:00 室温 150 µL

9.3 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド2

BONDステップ ✓ 試薬 ステップの種類 インキュベーション時間 (分) 温度 (℃) 分注タイプ
1 □ 0.1X TBST Solution 洗浄 0:00 室温 オープン
2 □ 0.1X TBST Solution 洗浄 0:00 室温 オープン
3 □ SignalStar Stripping Buffer 試薬 60:00 37° 150 µL
4 □ SignalStar Stripping Buffer 試薬 60:00 37° 150 µL
5 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
6 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
7 □ *脱イオン化水 洗浄 0:00 室温 オープン
8 □ MARKER (SignalStar Imaging Round 2 Solution) 一次 40:00 室温 150 µL
9 □ 1X TBST Solution 試薬 5:00 室温 オープン
10 □ 0.1X TBST Solution 試薬 5:00 室温 オープン
11 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
12 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
13 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
14 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
15 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
16 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
17 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
18 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
19 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
20 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
21 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
22 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
23 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
24 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
25 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
26 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
27 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
28 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
29 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
30 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
31 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
32 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
33 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
34 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
35 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
36 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
37 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
38 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
39 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
40 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
41 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
42 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
43 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
44 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 8:00 室温 150 µL
45 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
46 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
47 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
48 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
49 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
50 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
51 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
52 □ SignalStar Amplification Solution 1 試薬 08:00 室温 150 µL
53 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
54 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
55 □ 0.1X TBST Solution 試薬 0:00 室温 オープン
56 □ SignalStar Amplification Solution 2 試薬 16:00 室温 150 µL
57 □ 0.1X TBST Solution 試薬 00:00 室温 オープン
58 □ 0.1X TBST Solution 試薬 00:00 室温 オープン
59 □ 0.1X TBST Solution 試薬 00:00 室温 オープン
60 □ SignalStar Ligation Solution 試薬 20:00 室温 150 µL
61 □ 0.1X TBST Solution 試薬 00:00 室温 オープン
62 □ 0.1X TBST Solution 試薬 00:00 室温 オープン
63   BOND Wash Solution 洗浄 00:00 室温 150 µL

10 Appendix

10.1 SignalStarパネルデザインの例

オリゴ標識抗体 相補的オリゴ 製品ペア＃ イメージングラウンド 488 594 647 750
PD-1 (Intracellular Domain) (D4W2J)
Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0008)		 相補的オリゴ
(CO-0008-488)		 17942 1 •      
PD-L1 (E1L3N®) Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0005)		 相補的オリゴ
(CO-0005-594)		 28249 1   •    
TIM-3 (D5D5R™) Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0010)		 相補的オリゴ
(CO-0010-647)		 15231 1     •  
Ki-67 (8D5) Mouse Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0014)		 相補的オリゴ
(CO-0014-750)		 56398 1       •
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0004)		 相補的オリゴ
(CO-0004-488)		 45747 2 •      
CD68 (D4B9C) Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0007)		 相補的オリゴ
(CO-0007-594)		 77318 2   •    
CD20 (E7B7T) Rabbit Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0011)		 相補的オリゴ
(CO-0011-647)		 36775 2     •  
Pan-Keratin (C11) Mouse Monoclonal Antibody
(SignalStar™ Conjugate 0003)		 相補的オリゴ
(CO-0003-750)		 97227 2       •

10.2 トラブルシューティングとよくある質問

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーでお選びいただける各抗体を厳密に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、従来の発色アッセイでも用いられるこれらの抗体は、この蛍光アッセイの基礎となるため、厳密に試験されています。

このアッセイは凍結組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、凍結組織での使用に対してはまだ検証されていません。現在、新鮮組織または凍結組織で使用するための抗体とプロトコールを検証中です。

抗マウス抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、マウス組織での使用に対してはまだ検証されていません。'現在、抗マウス抗体を検証中です。'

利用可能な抗体のリストに標的が見当たりません。それでも何らかの方法で、パネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCキット&試薬は、リストに含まれない抗体との使用に対してはまだ検証されていません。'現在、SignalStar Multiplex IHCアッセイで、お手持ちの抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、直接標識抗体と組み合わせての使用に対してはまだ検証されていません。'直接標識抗体をプロトコールに取り入れることは可能であると考えられます。しかし、SignalStar試薬は、蛍光シグナルを増幅するという利点があるため、増幅されていない直接標識抗体と共に使用した際に、スペクトルの漏れ込みが発生する可能性があります。

連続切片のSignalStar染色を発色染色と比較すると、より多くの陽性細胞が観察されます。この過剰な染色が正しいかどうかを、どのように確認すればよいですか？

最適化の過程で、蛍光染色では発色染色よりも高い陽性率 (%) を示す可能性があることが分かりました。'過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色との共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8陽性細胞がCD3陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

イメージングラウンド1は、染色完了後、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。イメージングラウンド2では、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、使用予定の組織に対して最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。標的の特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどの調整を行うことにより、実験で最適なシグナルを取得できます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？ 複数のコントロールが必要ですか？

各標的について、発色IHCで陽性であることが示されたあらゆる組織がポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを使用してください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Cell Signaling Technology and SignalStar are trademarks of Cell Signaling Technology, Inc.
E1L3N is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc. Cy and CyDye are registered trademarks of GE Healthcare. All other trademarks are the property of their respective owners. Visit our Trademark Information page.
© 2023 Cell Signaling Technology, Inc. All Rights Reserved.

作成日：2023年7月