蛍光ウェスタンブロッティングのリソース

注意：最良の結果を得るために、Cell Signaling Technology (CST) は、各製品に対して最適化したアプリケーションごとのプロトコールを使用することを強く推奨しています。推奨プロトコールは、CSTで実施された徹底的な社内検証に基づいて作成され、これを用いることで正確かつ再現性の高い結果が得られます。

蛍光標識二次抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、より正確な定量と異なる動物種由来の一次抗体を用いた二重検出が可能になります。同じ転写膜でリン酸化およびトータルタンパク質のレベルを測定できたり、異なる分子量の異なる標的タンパク質の制御を同時に調べたりすることが可能です。ただし、一次抗体のアフィニティーは様々で、二つの抗体の結果を直接比較することはできません。標準化する必要があるという点を念頭に置くことは重要です。場合によっては、 蛍光検出は化学発光検出ほど感度が高くないため、低い発現レベルのタンパク質の検出には適さないことがあります。また、蛍光ウェスタンブロッティングの検出を行う場合、蛍光イメージャーのような専用の装置が必要です。

Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP^® Rabbit mAb (#4370) およびp44/42 MAPK (Erk1/2) (3A7) Mouse mAb (#9107) を用いて、未処理か、U0126 (#9903) (10 µM、1時間) またはTPA (#4174) (200 nM、10分間) のいずれかで処理したCOS細胞の抽出物を用いたウェスタンブロッティング解析。

Raw264.7細胞抽出物のウェスタンブロッティング解析、iNOS抗体 (#2977)、未処理またはLPS処理 (1 µg/mL、6時間)。

CSTは蛍光ウェスタンブロッティングの改良済みプロトコールを提供しています。必要とされる唯一の重要な改良ポイントは、ブロッキングのステップでTween-20を除くことです。プロトコールの詳細は、「蛍光ウェスタンブロッティングプロトコール」(BSAの一次抗体反応) ​、CSTの「蛍光ウェスタンブロッティングプロトコール」(脱脂粉乳の一次抗体反応)​ をご確認ください。加えて、 CSTのPrestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720 は、近赤外の波長で自家蛍光を発します。

二色同時検出のウェスタンブロットでは、異なる種の一次抗体と、異なる色素で標識した適切な二次抗体が必要です。2つの一次抗体で異なる抗体希釈液の使用が推奨されている場合、各一次抗体を両方のバッファーで個々に試験し、二重検出に適した抗体希釈液を検討しなければなりません。しかし、抗体の組み合わせの中には、エピトープの重複や、一次抗体や二次抗体によって起こる干渉、一次抗体の抗体希釈液の不適合などにより、適切にワークしないものもあります。