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MNaseによるCUT&RUN Input DNAの消化

Fragmentation of input DNA is required for compatibility with downstream NG-Sequencing but is not necessary for downstream qPCR analysis. If a sonicator is not available, we recommend using the un-fragmented input DNA for qPCR analysis; however, the input DNA should be purified using phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation because the size of un-fragmented input DNA is too large to be purified using DNA spin columns. If a sonicator is not available and downstream NG-Sequencing analysis is desired, one can use the CUT&RUN normal IgG antibody sample as the negative control, although this is not ideal because the normal IgG-enriched sample may show non-specific DNA enrichment. Alternatively, an input DNA fragmentation protocol using MNase is available as below.

注意:The following reagents are required for CUT&RUN input DNA digestion and are not included in our CUT&RUN Assay Kit #86652: SimpleChIP® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282, Micrococcal Nuclease #10011, DTT (Dithiothreitol) #7016, 0.5 M EDTA #7011, 10% SDS Solution #20533, DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209, and nuclease-free water #12931. If one is not using our CUT&RUN Assay Kit #86652, please also purchase the following reagents separately: Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569, Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012, Proteinase K (20 mg/ml) #10012, and RNAse A (10 mg/ml) #7013.

実験開始前の準備:

! All buffer volumes should be increased proportionally based on the number of input DNA samples.

  • Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上に置いてください。
  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に完全に解凍されていることを確認してください。
  • Prepare 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12ml dH2O). DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。

    (!!) 重要:一旦溶液にした1M DTTは、-20℃で保存してください。

  • Prepare 1 ml of 1X Buffer A (250 µl 4X Buffer A #7006 + 750 µl nuclease-free water #12931 + 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC) per input sample and place on ice.
  • Prepare 1.2 ml of 1X Buffer B (300 µl 4X Buffer B #7007 + 900 µl nuclease-free water #12931 + 0.6 µl 1M DTT) per input and place on ice.
  1. Concanavalin A Magnetic Beadsを、ビーズ懸濁液がチューブからこぼれないように注意深くピペッティングで上下させて再懸濁してください。Transfer 10 µl of the bead suspension per input sample to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.

    注意:ホルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから外れてしまうことがあるので、Concanavalin A Magnetic Beadsはボルテックスしないでください。

  2. ビーズ懸濁液10 µLごとにConcanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで静かに上下させてビーズを混合してください。
  3. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いてください。

    注意:To avoid loss of beads, remove liquid using a pipet. 真空吸引はしないでください。

  4. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ2と3を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
  5. ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (サンプルあたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。
  6. Add 10 µl of activated bead suspension to each input sample prepared in Section I of CUT&RUN Assay Kit #86652 protocol.
  7. チューブを室温で5分間転倒撹拌してください。

    注意:Concanavalin A Magnetic Beadsは、塊になったりチューブの側面に付着したりすることがあります。Rocking instead of rotating the tubes may help to mitigate this issue. ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁できます。

  8. Briefly centrifuge the sample at 100 x g for 2 sec to remove cell:bead suspension from the cap of the tube. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いて破棄してください。
  9. チューブを磁気ラックから外してください。Resuspend cell:bead suspension in 1 ml ice-cold 1X Buffer A + DTT + PIC per input sample. 氷上で10分間インキュベートしてください。Invert the sample every 3 min.
  10. Briefly centrifuge the sample at 100 x g for 2 sec to remove cell:bead suspension from the cap of the tube. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いて破棄してください。
  11. Resuspend cell:bead suspension in 1 ml ice-cold 1X Buffer B + DTT per input sample. Repeat Step 10 and resuspend pellet in 100 µl 1X Buffer B +DTT per input sample.
  12. Dilute 1 µl Micrococcal Nuclease #10011 1:40 by adding 39 µl of 1X Buffer B + DTT. Add 0.5 µl of diluted Micrococcal Nuclease to each input sample, mix by pipetting up and down. Incubate for 20 min at 37°C with frequent mixing to digest DNA to length of approximately 150 bp.

    注意:Do NOT save the remaining diluted Micrococcal Nuclease for future experiments. Micrococcal Nuclease is not stable for long periods of time in Buffer B + DTT.

  13. Stop digestion by adding 10 µl of 0.5 M EDTA #7011 per input sample.
  14. Add 1 µl of 10% SDS Solution #20533 (0.1% final concentration), 2 µl of proteinase K (20 mg/ml) #10012, and 0.5 µl of RNAse A #7013 to each sample. Vortex to mix.
  15. Incubate sample at 65°C for 2 hr.
  16. After incubation, spin samples at 16,000g for 2 min.
  17. Place the tube on the magnetic rack until the solution turns clear (30 sec to 2 min).
  18. Collect supernatant and continue with Section VI-A of CUT&RUN Assay Kit #86652 Protocol (DNA Purification Using Spin Columns) to purify input DNA.

    注意:During DNA spin column purification, be sure to add 550 µl of DNA Binding Buffer to each input sample to have 5 volumes of DNA Binding Buffer for every 1 volume of sample.

更新:2021年9月

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