MNaseによるCUT&RUNインプットDNA消化プロトコール

下流解析で NG-シーケンシングを行う場合はインプットDNAの断片化が必要ですが、qPCRの場合は必須ではありません。ソニケーター を利用できない場合は、qPCR解析には断片化していないインプットDNA の使用を推奨しますが、 断片化していないインプットDNAはサイズが大きすぎてDNAスピンカラムで精製できないため、 フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する必要があります。 下流解析でNG-シーケンシングを 行う際にソニケーターが利用できない場合は、正常IgGを用いたCUT&RUNサンプルを ネガティブコントロールとして使用することもできますが、正常IgGでは非特異的に DNAが濃縮される場合があり、理想的ではありません。代替法として、下記のようにMNaseを利用してインプットDNAを 断片化するプロトコールがあります。

注意：CUT&RUN インプットDNAを酵素消化で断片化する場合、弊社のCUT&RUN Assay Kit #86652または CUTRUN Assay Kit#86652 or our CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647に含まれない、下記の試薬が必要です。SimpleChIP^® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282、Micrococcal Nuclease #10011, DTT (Dithiothreitol) #7016、0.5 M EDTA #7011、10% SDS Solution #20533、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209、Nuclease-free Water #12931。弊社のCUT&RUN Assay Kit #86652またはCUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647を使用していない場合は、 以下の試薬も別途ご購入ください。Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569、Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012、Proteinase K (20 mg/mL) #10012、およびRNAse A (10 mg/mL) #7013。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、インプットDNAサンプルの数に比例して 増加させる必要があります。

注意：すべてのインキュベーションステップにおいて、振盪または回転によってサンプルを混合させる必要はありません。チューブを指定の温度でラック上に 静置 するだけで構いません。混合してもアッセイ性能は向上せず、 むしろチューブ壁やキャップに付着することでビーズの凝集やビーズの損失を引き起こす可能性があります。

• Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上で保持してください。
• 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に、 完全に解凍されていることを必ず確認してください。
• 1 M DTT (DTT #7016 192.8 mg + dH₂O 1.12 mL) を調製してください。DTTの結晶が完全に溶解されていることを必ず確認してください。

  !! 重要：一旦溶液にした 1 M DTTは、-20°Cで保存してください。

• 1インプットサンプルにつき、1X Buffer A (4X Buffer A #7006 250 µL + Nuclease-free Water #12931 750 µL + 1M DTT 0.5 µL + 200X PIC 5 µL) を1 mLを調製し、氷上で保持してください。
• 1インプットサンプルにつき、1X Buffer B (4X Buffer B #7007 300 µL + Nuclease-free Water #12931 900 µL + 1M DTT 0.6 µL) 1.2 mLを調製し、氷上で保持してください。

1. Concanavalin A磁気ビーズを、ビーズ懸濁液がチューブからこぼれないように慎重にピペッティングで上 下させて再懸濁してください。 インプット1サンプルにつきビーズ懸濁液10 µLを新しい1.5 mL微量遠心分離用チューブに移してください。

   注意：ボルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから 外れてしまうことがあるので、Concanavalin A磁気 ビーズはボルテックスしないでください。

2. ビーズ10 µLにつき、Concanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを 加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを混合してください。
3. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2 分間)、その後、液体を取り除いてください。

   注意：ビーズの損失を避けるため、液体は ピペットを使用して取り除いてください。真空吸引はしないでください。

4. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ2と3を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
5. ビーズ懸濁液の最初の 量と同量 (1サンプルにつき10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、 ピペッティングで上下させて再懸濁してください。
6. CUT&RUN Assay Kit #86652プロトコールまたはCUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647プロトコールのセクションIIで調製した 各インプットサンプルに、活性化ビーズ懸濁液10 µLを加えてください。
7. サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。
8. サンプルを軽く遠心分離して (100 x gで2秒間)、チューブのキャップから細胞とビーズの 懸濁液を落としてください。チューブを溶液が透明になるまで 磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を 除去して破棄してください。
9. チューブをスタンドから外してください。氷冷した1X Buffer A + DTT + PICを、1インプットサンプルにつき1 mL加え、 細胞とビーズを再懸濁してください。氷上で10 分間インキュベートしてください。
10. サンプルを軽く遠心分離して (100 x gで2秒間)、チューブのキャップから細胞とビーズの 懸濁液を落としてください。チューブを溶液が透明になるまで 磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を 除去して破棄してください。
11. 氷冷した1X Buffer B + DTTを、1インプットサンプルにつき1 mL加え、 細胞とビーズを再懸濁してください。ステップ10を繰り返し、1インプットサンプルにつき1X Buffer B + DTT 100 µLでペレットを再懸濁してください。
12. Micrococcal Nuclease #10011 1 µLを1X Buffer B + DTT 39 µLに加え、1：40に希釈してください。それぞれのインプットサンプルに、希釈したMicrococcal Nucleaseを0.5 µL加え、 ピペッティングで上下させて混和してください。頻繁に混合しながら20分間、 37°Cでインキュベートし、DNAを約150 bpの長さになるように消化してください。

    注意：希釈したMicrococcal Nucleaseの残りは、次回以降の実験に使用しないでください。Micrococcal NucleaseはBuffer B + DTT中で、 長期間安定ではありません。

13. 1インプットサンプルにつき、0.5 M EDTA #7011を10 µL加え、消化を停止させてください。
14. 各サンプルに、10% SDS Solution #20533を1 µL (最終濃度0.1%)、Proteinase K (20 mg/mL) #10012を2  µL、 RNAse A #7013を0.5 µL 加えてください。ボルテックスして混合してください。
15. サンプルを65°Cで2時間、インキュベートしてください。
16. インキュベーション後、サンプルを16,000 gで2分間、遠心分離してください。
17. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置いてください (30秒間から 2分間)。
18. 上清を採取し、 インプットDNAを精製するために、CUT&RUN Assay Kit #86652プロトコールのセクションVII-A またはCUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647プロトコール (スピンカラムを用いたDNA精製) に進んでください。

    注意：DNAスピンカラム法で精製を行う場合、 必ず、サンプル体積1に対してDNA Binding Buffer体積が5倍 量になるように、DNA Binding Bufferを550 µL加えてください。