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MNaseによるCUT&RUNインプットDNAの消化

下流解析でNG-sequencingを行う場合はライブラリーを調製するためにインプットDNAの断片化が必要ですが、下流解析がqPCRの場合は必須ではありません。ソニケーターを利用できない場合、qPCR解析にはインプットDNAを断片化せずに使用することを推奨しますが、断片化していないインプットDNAはサイズが大きすぎてDNAスピンカラムで精製できないので、フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製する必要があります。ソニケーターが利用できず、下流解析でNG-sequencingが必要な場合は、正常IgGを用いたCUT&RUNサンプルをネガティブコントロールとして使用することもできますが、正常IgGでは非特異的にDNAが濃縮される場合があり、理想的ではありません。代替法として、下記のようにMNaseを利用してインプットDNAを断片化するプロトコールがあります。

注意:CUT&RUNインプットDNAを酵素消化で断片化する場合、弊社のCUT&RUN Assay Kit #86652に含まれない、下記の試薬が必要になります。SimpleChIP® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282、Micrococcal Nuclease #10011、DTT (Dithiothreitol) #7016、0.5 M EDTA #7011、10% SDS Solution #20533、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209、 Nuclease-free water #12931。弊社のCUT&RUN Assay Kit #86652を使用しない場合は、次の試薬も別途ご購入ください。Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569、 Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012、Proteinase K (20 mg/mL) #10012、およびRNAse A (10 mg/mL) #7013

実験開始前の準備:

! すべてのバッファーの量は、インプットDNAサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

  • Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上に置いてください。
  • 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012を取り出し、室温に戻してください。使用前に完全に解凍されていることを確認してください。
  • 1 M DTTを調製してください (DTT #7016 192.8 mg + dH2O 1.12 mL)。DTTの結晶が完全に溶解されていることを確認してください。

    (!!) 重要:一旦溶液にした1M DTTは、-20℃で保存してください。

  • インプット1サンプル当たり、1X Buffer Aを1 mL (4X Buffer A #7006 250 μL + Nuclease-free water #12931 750 µL + 1M DTT 0.5 µL + 200X PIC 5 µL) を調製し、氷上に置いてください。
  • インプット1サンプル当たり、1X Buffer Bを 1.2 mL (4X Buffer B #7007 300 µL + Nuclease-free water #12931 900 µL + 1M DTT 0.6 µL) 調製し、氷上に置いてください。
  1. Concanavalin A Magnetic Beadsを、ビーズ懸濁液がチューブからこぼれないように注意深くピペッティングで上下させて再懸濁してください。ビーズ懸濁液10 µLを新しい1.5 mLチューブに移してください。

    注意:ホルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから外れてしまうことがあるので、Concanavalin A Magnetic Beadsはボルテックスしないでください。

  2. ビーズ懸濁液10 µLごとにConcanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで静かに上下させてビーズを混合してください。
  3. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いてください。

    注意:ビーズの損失を避けるため、液体はピペットを使用して取り除いてください。真空吸引はしないでください。

  4. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ2と3を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。
  5. ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (サンプルあたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。
  6. CUT&RUN Assay Kit #86652 プロトコールのセクション Iで調製したインプットサンプルに、活性化したビーズ懸濁液をそれぞれ10 µL加えてください。
  7. チューブを室温で5分間転倒混和してください。

    注意:Concanavalin A Magnetic Beadsは、塊になったりチューブの側面に付着したりすることがあります。転倒混和ではなく、振盪混和することでこの問題が解決する場合があります。ビーズはピペッティングで上下させて再懸濁してください。

  8. チューブを100 x gで2秒間、短時間遠心分離して、キャップから細胞とビーズの懸濁液を落としてください。チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いて破棄してください。
  9. チューブを磁気ラックから外してください。氷冷した1X Buffer A + DTT + PICを、インプット1サンプル当たり1 mL加え、細胞とビーズを再懸濁してください。氷上で10分間インキュベートしてください。3分ごとにサンプルを転倒混和してください。
  10. チューブを100 x gで2秒間、短時間遠心分離して、キャップから細胞とビーズの懸濁液を落としてください。チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後、液体を取り除いて破棄してください。
  11. 氷冷した1X Buffer A + DTTを、インプット1サンプル当たり1 mL加え、細胞とビーズを再懸濁してください。ステップ10を繰り返し、ペレットを、インプット1サンプル当たり1X Buffer B + DTT 100 µLに再懸濁してください。
  12. Micrococcal Nuclease #10011 1µLを1X Buffer B + DTT 39 µLに加え、1:40 希釈してください。それぞれのインプットサンプルに、希釈したMicrococcal Nucleaseを0.5 µL加え、ピペッティングで上下させて混和してください。頻繁に攪拌しながら37℃で20分間インキュベートし、DNAを約150 bpの長さまで消化してください。

    注意:希釈したMicrococcal Nucleaseの残りを保存して、次回以降の実験に使用しないでください。Micrococcal NucleaseはBuffer B + DTT中で、長期間安定ではありません。

  13. インプット1サンプル当たり、0.5M EDTA #7011を10 µL加え、消化を停止させてください。
  14. 各サンプルに、10% SDS Solution #20533を1 µL (終濃度0.1%)、Proteinase K (20 mg/mL) #10012を2 µL、RNAse A #7013を0.5 µL加えてください。ボルテックスして混合してください。
  15. サンプルを65°Cで2時間、インキュベートしてください。
  16. インキュベーション後、サンプルを16,000gで 2 分間、遠心分離してください。
  17. チューブを溶液が透明になるまで磁気ラックに置いてください (30秒間から2分間)。
  18. 上清を回収し、CUT&RUN Assay Kit #86652プロトコールのセクションVI-A (スピンカラムを用いたDNAの精製) でインプットDNAの精製を続けてください。

    注意:DNAスピンカラムで精製を行う場合、サンプル体積1に対してDNA Binding Buffer体積が5になるように、DNA Binding Bufferを550 µL加えることをご確認ください。

更新:2021年9月

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