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InTraSeq™ 3'プロトコール

InTraSeq™ 3'プロトコール

最適な結果を得るために：

  • RNaseフリーで無菌の作業スペースでの実験を推奨します。
  • フィルター付きピペットチップの使用を推奨します。
  • セクションB. ブロッキング (2日目) からプロトコールの最後まで、850 x g で遠心することが重要です。850 x RPMではありません。
  • セクションC. 免疫染色 (2日目) のプロトコールでは、上清を除去する際に細胞ペレットを溶液に浸した状態を保つ (約40 µL) ことが重要です。
  • いずれのステップにおいても、上清を除去する際は、真空吸引ではなく必ずピペットを使用してください。
  • 試薬を使用する前に、完全に解凍されていることを確認してください。

注意：

  • InTraSeq™ 3'アッセイキットの構成品はすべて、フィーチャーバーコード標識技術を備えた10x Genomics社のChromium Single Cell 3'キットで検証されています。
  • SAFE STOP - 実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。
  • このプロトコールは、InTraSeq™アッセイ (1サンプル) 用に設計されています。複数のサンプルを処理する場合は、すべての量を比例して調整する必要があります。

溶液および試薬

キットの構成品 (-20°C保管)

  • InTraSeq™ Blocking Buffer A #10471
  • InTraSeq™ Blocking Buffer B #31701
  • InTraSeq™ Staining Buffer #46005
  • InTraSeq™ Wash Buffer #59335
  • InTraSeq™ Reducing Agent #63760
  • InTraSeq™ RNase Inhibitor #79298
  • Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) #81472
  • Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) #68984

キットに含まれない必要試薬

  • InTraSeq™ 3' Conjugates/Antibody Cocktails
  • Two sterile 40-micron Falcon cell strainers
  • Vortex mixer
  • 1.5 mL Sterile Polypropylene Microcentrifuge Tubes - LoBind
  • 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes (preferably LoBind)
  • 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes (preferably LoBind)
  • Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  • Methanol #13604

実験開始前の準備：

(オプション) キットが届いたら、InTraSeq™ Blocking Buffer Aを解凍し、ピペットで混合して875 µLずつ1.5 mLの滅菌マイクロチューブ8本に分注します。

A. 細胞の固定 (1日目)

注意：このプロトコールの前に免疫染色ステップを実行する場合は、以下のステップ1で100万-500万個の細胞を確保するために、少なくとも200万個の細胞で免疫染色を開始することを強く推奨します。

  1. 細胞をカウントして、100万-500万個の細胞を15 mLチューブに移してください。

    注意：100万個未満の細胞で実験を進めないでください。

  2. 細胞を4°Cで5分間、300 x gで遠心してください。
  3. 上清を除去して廃棄し、氷冷した1X PBS 10 mLで細胞を洗浄してください。
  4. 細胞を4°Cで5分間、300 x gで遠心してください。
  5. 細胞ペレットを乱さないように上清を除去して廃棄し、氷冷した1X PBS 0.5 mLで細胞を懸濁してください。
  6. ボルテックスミキサーの電源を入れて、スイッチを「オン」モード (「オート/タッチ」モードではありません) に設定し、低速 (ミキサーに応じて速度1-4) を維持してください。サンプルが渦を巻くほど激しく撹拌されるのではなく、常に混合されている状態を維持できるようにしてください。サンプルが激しく撹拌されてしまう場合は、ミキサーの速度を下げてください。

    注意：以下のステップでは、氷冷したメタノールをゆっくり (30秒以上かけて) 滴下することが非常に重要です。

  7. 細胞の入った15 mLチューブを「オン」モードにしたボルテックスミキサー上にセットし、4.5 mLの氷冷したメタノールをゆっくりと (30秒以上かけて) 滴下してください。
  8. 細胞を‐20°Cの冷凍庫で一晩インキュベートしてください。(SAFE STOP：サンプルは、-20°Cの冷凍庫内で最大7日間保存できます。)

B. ブロッキング (2日目)

このセクション以降は、遠心の各ステップにおいて細胞を850 x gでスピンダウンすることが重要です。スピンダウンの速度を下げると、細胞を損失する可能性があります。

  1. 以下の製品を室温で解凍してください：
    • InTraSeq™ Wash Buffer：1ボトル
    • InTraSeq™ Blocking Buffer B
    • InTraSeq™ Blocking Buffer A：解凍し、ピペットで混合してください。
    • InTraSeq™ Staining Bufferを解凍し、ピペットで混合してください。
    • InTraSeq™ Reducing Agent：解凍し、沈殿物がなくなるまでボルテックスで混合してください。
  2. 解凍後、各試薬を氷上に静置してください。
  3. Heat/cooled InTraSeq™ Blocking Buffer Bを準備してください：
    1. 130 µLのInTraSeq™ Blocking Buffer B を、1.5 mLの滅菌マイクロチューブに分注してください。分注元のInTraSeq™ Blocking Buffer Bは、冷凍庫に戻してください。
    2. 分注したチューブを、95°Cで5分間加熱してください。
    3. チューブをスピンダウンし、氷上に静置してください。以下のステップで、このHeat/cooled InTraSeq™ Blocking Buffer Bを使用します。
  4. scBlock (下表を参照) を準備し、ピペットで混合して氷上に静置してください。
    scBlock 分量
    InTraSeq™ Blocking Buffer A 860 µL
    Heat/cooled InTraSeq™ Blocking Buffer B 98 µL
    InTraSeq™ Reducing Agent 40 µL
    InTraSeq™ RNase Inhibitor 2 µL
    総量 1,000 µL
  5. 細胞を、4°Cで5分間、850 x gで遠心してください。
  6. 上清を除去して廃棄し、細胞にscBlockを加えてください。ピペットで細胞を懸濁させた後、少なくとも30分間は氷上に静置してください。
  7. scBlock内でインキュベーションしている間に、以下のAntibody Master Mixを準備してください：
    1. Vol. of Abs. (使用する抗体の量) は、InTraSeq™ 3'用抗体カクテルと個々のInTraSeq™ 3'標識抗体 (Ind. InTraSeq™ 3' Conj.またはInd. Conj.) の数に応じて、下表を参照して決定してください。総量を30 µLとして計算してください。
        分量
      (Cocktailのみ)      		 分量
      (Ind. Conj.のみ)      		 分量
      (Cocktails + Ind. Conj.)
      InTraSeq™ 3' Cocktail  5 µL (per cocktail) N/A ___ µL (5 µL per cocktail)
      Ind. InTraSeq™ 3' Conj. N/A 3 µL (1Ind. Conj.) ___ µL (3 µL per Ind. Conj.)
      Vol. of Abs. ___ µL ___ µL ___ µL
    2. Antibody Master Mix (下表を参照) を、上で計算したVol. of Abs. (最大30 µL) を用いて調製してください。気泡の発生を最小限に抑えるため、ピペットで静かに混合し、氷上に静置してください。
      Antibody Master Mix 分量
      (Cocktailのみ)      		 分量
      (Ind. Conj.のみ)      		 分量
      (Cocktails + Ind. Conj.)
      Vol. of Abs. ___ µL ___ µL ___ µL
      InTraSeq™ Wash Buffer 30 µL - Vol. of Abs. (上の表を参照)
      InTraSeq™ Staining Buffer 55 µL 55 µL 55 µL
      Heat/cooled InTraSeq™ Blocking Buffer B 10 µL 10 µL 10 µL
      Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) 3 µL 3 µL 3 µL
      Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) またはその他のHistone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate) 3 µL 3 µL 3 µL
      InTraSeq™ RNase Inhibitor 2 µL 2 µL 2 µL
      総量 103 µL 103 µL 103 µL
  8. scBlock中で30分間インキュベーションした細胞に、2 mLのInTraSeq™ Wash Bufferを加えてピペットで混合してください。
  9. 40-micron Falcon cell strainerで細胞を濾過しながら50 mLチューブに移してください。

    注意：細胞回収率を最大化するためには、Falcon cell strainerにピペット先端を軽く押し付けながら、濾過してください。(下の写真を参照してください)

    Image 1
  10. 濾過した細胞を新しい15 mLチューブに移し、すぐにセクションC. 免疫染色 (2日目) に進んでください。

    注意：残ったInTraSeq™ Wash Bufferは、3日目に使用するため、4°Cで保存してください。

C. 免疫染色 (2日目)

このセクション以降は、上清を除去する際に細胞ペレットを溶液に浸した状態 (40 µL) に保つことが重要です。細胞を乾燥させるとRNAや細胞の収量が低下する可能性があります。

  1. 細胞を、4°Cで5分間、850 x gで遠心してください。
  2. チューブ内に液が約40 µL残るように上清を除去してください。
  3. 100 µLのAntibody Master Mixを細胞に加えてください。ピペットで細胞を懸濁してください。
  4. 1.5 mLの滅菌LoBindマイクロチューブに移し、4°Cで一晩インキュベートしてください (最大16時間まで)。

    注意：

    • 細胞を20時間以上インキュベートしないでください。
    • 4°Cで一晩インキュベーションすることが重要です。

     

D. 細胞の洗浄とカウント (3日目)

実験開始前の準備：

Image 2
  • Modified InTraSeq™ Wash Bufferを調製してください。気泡を最小限に抑えるために、ゆっくりとピペットで混合し、氷上で静置してください。

    注意：InTraSeq™ Wash Bufferが残った場合は、-20°Cで保存してください。

  1. 1 mLのModified InTraSeq™ Wash Bufferを、細胞が入った1.5 mLのマイクロチューブに加えてください。ピペットで混合した後、15 mLチューブに移してください。
  2. 2 mLのModified InTraSeq™ Wash Bufferを加えて、総量を3 mLにしてください。
  3. 4°Cで5分間、850 x gで遠心してください。チューブ内に液が約40 µL残るように上清を除去してください。
  4. 1 mLのModified InTraSeq™ Wash Bufferを加えてください。ピペットで細胞を懸濁し、さらに3 mLのModified InTraSeq™ Wash Bufferを加えて総量を4 mLにしてください。
  5. ステップ3とステップ4を繰り返した後、4 mLの細胞懸濁液を40-micron Falcon cell strainerで濾過しながら50 mLチューブに移してください。濾過した細胞懸濁液を、新しい15 mLチューブに移してください。

    注意：細胞回収率を最大化するためには、Falcon cell strainerにピペット先端を軽く押し付けながら、濾過してください。(下の写真を参照してください)

    Image 1
  6. 細胞を、4°Cで5分間、850 x gで遠心してください。チューブ内に液が約40 µL残るように上清を除去してください。
  7. 100 µLのModified InTraSeq™ Wash Bufferを細胞に加えてください。ピペットで細胞を懸濁し、氷上に静置してください。

    注意：このステップ以降は、細胞は、あらゆる希釈段階も含めてModified InTraSeq™ Wash Buffer中で保存してください。他のバッファーや試薬を使用すると、RNAが分解される可能性があります。

  8. 細胞をカウントしてください。必要な細胞濃度を決定するには、フィーチャーバーコード標識技術を備えた10x Genomics社のChromium Single Cell 3'キットのプロトコールに記載の細胞懸濁液用量計算表を参照してください。

    重要：目的の細胞濃度に希釈する際は、必ずModified InTraSeq™ Wash Bufferを使用してください。

    注意：カウント後の細胞に凝集が見られる場合は、次に進む前にゆっくりとピペッティングしてください。

  9. フィーチャーバーコード標識技術を備えた10x Genomics社のChromium Single Cell 3'キットを使用して、次のステップに進んでください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

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