Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) プロトコール

次世代シーケンシング (NG-seq) は、クロマチン免疫沈降 (ChIP) やCUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) アッセイの下流で使用可能なハイスループット解析であり、ゲノム全体にわたる標的DNAの濃縮の特定や定量に用いられます。Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) には、Illuminaシステムプラットフォーム (Illumina, Inc.) でNG-seq解析を行うために必要な、マルチプレックスサンプルの調製に最適なアダプターとプライマーが含まれています。このキットは、ChIP-seqまたはCUT&RUN用の、最大96種類の異なるバーコード標識をもつDNAライブラリーを調製できます。これらのライブラリーは、まとめて1回のシーケンシング反応で解析できます。

各キットの構成品は、厳格な品質管理基準を満たしています。また、新ロットごとに、キット一式をIlluminaシステムシーケンシングプラットフォーム上でのインデックスライブラリーの構築およびシーケンシングで検証してます。

この製品には、最大96種類のバーコード標識をもつDNAシーケンシングライブラリーを調製するのに十分な量の試薬が含まれます。この製品は、DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と組み合わせて使用する必要があります。

適合するアッセイキット：
CUT&RUN Assay Kit #86652
SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647

適合しないアッセイキット：
CUT&Tag Assay Kit #77552
SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
注意：アガロースビーズは、ソニケートされたサケ精子DNAでブロッキングされており、これはDNAライブラリーやNG-seqに混入する恐れがあります。

必要な試薬：
キットに含まれる試薬：

1. • (赤) Adaptor for Illumina Systems #42436
2. • (赤) USER Enzyme #59713
3. º (白) Index 501 Primer for Illumina Systems #86676
4. º (白) Index 502 Primer for Illumina Systems #92596
5. º (白) Index 503 Primer for Illumina Systems #29576
6. º (白) Index 504 Primer for Illumina Systems #46325
7. º (白) Index 505 Primer for Illumina Systems #67343
8. º (白) Index 506 Primer for Illumina Systems #89663
9. º (白) Index 507 Primer for Illumina Systems #27649
10. º (白) Index 508 Primer for Illumina Systems #40566
11. • (オレンジ) Index 701 Primer for Illumina Systems #60797
12. • (オレンジ) Index 702 Primer for Illumina Systems #79999
13. • (オレンジ) Index 703 Primer for Illumina Systems #18697
14. • (オレンジ) Index 704 Primer for Illumina Systems #26125
15. • (オレンジ) Index 705 Primer for Illumina Systems #39467
16. • (オレンジ) Index 706 Primer for Illumina Systems #51808
17. • (オレンジ) Index 707 Primer for Illumina Systems #58724
18. • (オレンジ) Index 708 Primer for Illumina Systems #65787
19. • (オレンジ) Index 709 Primer for Illumina Systems #75272
20. • (オレンジ) Index 710 Primer for Illumina Systems #99422
21. • (オレンジ) Index 711 Primer for Illumina Systems #10812
22. • (オレンジ) Index 712 Primer for Illumina Systems #38569
23. Index Primer Orange Tube Caps #54631
24. Index Primer White Tube Caps #70942

キットに含まれない試薬：

1. Illuminaシステム用のChIPまたはCUT&RUNライブラリー調製に適した酵素およびバッファー：DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795に含まれています。
2. Nuclease-free Water #12931
3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
4. 用時調製した80%エタノール
5. 1X TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)
6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
7. 磁気分離ラック
8. Agilent BioanalyzerまたはTapeStationシステム (Agilent Technologies, Inc.)
9. PCRチューブとPCR装置

I. ロープレックスでサンプルをプールする場合のガイドライン：

デュアルインデックスプライマー方式では、それぞれ異なる8塩基のインデックス配列を含む2種類のプライマーを使用します。Index 7プライマーは、P7配列の隣にインデックス配列を含みます。一方、Index 5プライマーは、P5配列の隣にインデックス配列を含みます。シーケンスするサンプルの両端にそれぞれ固有のインデックス配列を付加することにより、デュアルインデックスの検出が可能になります。12種類のIndex 7プライマーと、8種類のIndex 5プライマーを組み合わせることで、最大96種類の異なるサンプルをインデックス化できます。

IlluminaシステムのNG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスに赤色レーザー/LEDを、G/Tのシーケンスに緑色レーザー/LEDを使用しています。サイクルごとに赤と緑の両方のチャンネルで読み取り、これらを用いて画像の正確なレジストレーションを行います (すなわち、各サイクルでAかCのいずれかと、GかTのいずれかが存在する必要があります)。インデックスリードのシーケンシングの際にこのカラーバランスが保たれていない場合、解析が失敗する可能性があります。各サイクルで赤と緑の両方のシグナルが確実に得られる設定になっているか、各インデックス配列を確認してください。以下の例を参照してください：

Illuminaシステム用Index 7プライマー		Illuminaシステム用Index 5プライマー
Illuminaシステム用Index 701プライマー	ATTACTCG	Illuminaシステム用Index 503プライマー	CCTATCCT
Illuminaシステム用Index 702プライマー	TCCGGAGA	Illuminaシステム用Index 504プライマー	GGCTCTGA
Illuminaシステム用Index 703プライマー	CGCTCATT	Illuminaシステム用Index 505プライマー	AGGCGAAG
Illuminaシステム用Index 704プライマー	GAGATTCC	Illuminaシステム用Index 506プライマー	TAATCTTA
	✔✔✔✔✔✔✔✔		✔✔✔✔✔✔✔✔

Illuminaシステム用Index 7プライマー			Illuminaシステム用Index 5プライマー
Illuminaシステム用Index 701プライマー	ATTACTCG	Illuminaシステム用Index 502プライマー		ATAGAGGC
Illuminaシステム用Index 702プライマー	TCCGGAGA	Illuminaシステム用Index 504プライマー		GGCTCTGA
Illuminaシステム用Index 703プライマー	CGCTCATT	Illuminaシステム用Index 506プライマー		TAATCTTA
Illuminaシステム用Index 704プライマー	GAGATTCC	Illuminaシステム用Index 508プライマー		GTACTGAC
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下の表は、一緒にシーケンスできる有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) をリスト化したものです。

プレックス数	Illuminaシステム用Index 7プライマー	Illuminaシステム用Index 5プライマー
2	Index 701、Index 702 Index 703、Index 704 Index 705、Index 706 Index 707、Index 708 Index 709、Index 710 Index 711、Index 712	任意のIndex 5プライマー
3	Index 701、Index 702、Index 703 Index 703、Index 704、Index 705 Index 705、Index 706、Index 707 Index 707、Index 708、Index 709 Index 709、Index 710、Index 711	任意のIndex 5プライマー
4	Index 701、Index 702、Index 703、Index 704 Index 703、Index 704、Index 705、Index 706 Index 705、Index 706、Index 707、Index 708 Index 707、Index 708、Index 709、Index 710 Index 709、Index 710、Index 711、Index 712	任意のIndex 5プライマー
5-12	有効な4プレックスのIndex 7プライマーの組み合わせと、任意のi7プライマー (必要に応じた数)	任意のIndex 5プライマー
> 12	有効な4プレックスのIndex 7プライマーの組み合わせと、任意のi7プライマー (必要に応じた数)	Index 501、Index 502、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数) Index 503、Index 504、および他の Index 5プライマー (必要に応じた数) Index 505、Index 506、および他のIndex 5 プライマー (必要に応じた 数) Index 507、Index 508、および他のIndex 5プライマー (必要に応じた数)

その他の有効な組み合わせを下の表にまとめています。Index 7プライマーの有効なセットと、Index 5プライマーの有効なセットを選択してください。Index 5プライマーセットとIndex 7プライマーセットを組み合わせて、ご希望のサンプル数のライブラリー作製に適したPCR用プライマーセットを選定してください。

12サンプルをプールする場合	(1) 4種類のIndex 7プライマーセット * 3種類のIndex 5プライマーセット (2) 3種類のIndex 7 primerのセット * 4種類のIndex 5 primerのセット (3) 6種類のIndex 7プライマーセット * 2種類のIndex 5プライマーセット (4) 12種類のIndex 7プライマーセット * 1種類のIndex 5プライマーセット
26サンプルをプールする場合	(1) 6種類のIndex 7プライマーセット * 4種類のIndex 5プライマーセット これに、任意の2種類のIndex 5プライマー (上記の4種類以外) と組み合わせた任意のIndex 7プライマーを追加してください (2) 6種類のIndex 7プライマーセット * 5種類のIndex 5プライマーセット この30種類のプライマーペアのうちの26種類を用いて、26サンプルのライブラリーを増幅してください

II. Illuminaシステム用Index 5プライマー ：

Illuminaシステム用の各Index 5プライマーは、60 µLで提供されています。

Illuminaシステム用Index 501プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TATAGCCT
Illuminaシステム用Index 502プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATAGAGGC
Illuminaシステム用Index 503プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTATCCTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CCTATCCT
Illuminaシステム用Index 504プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTCTGAA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GGCTCTGA
Illuminaシステム用Index 505プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGCGAAGA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	AGGCGAAG
Illuminaシステム用Index 506プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAATCTTAA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAATCTTA
Illuminaシステム用Index 507プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCAGGACGTA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CAGGACGT
Illuminaシステム用Index 508プライマー	5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTACTGACA- CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GTACTGAC

-s-はホスホロチオエート結合を示しています。

III. Illuminaシステム用Index 7プライマー：

Illuminaシステム用の各Index 7プライマーは、40 µLで提供されています。

Illuminaシステム用Index 701プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATTACTCG
Illuminaシステム用Index 702プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCCGGAGA
Illuminaシステム用Index 703プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGAGCGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGCTCATT
Illuminaシステム用Index 704プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAATCTCGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GAGATTCC
Illuminaシステム用Index 705プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGAATGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATTCAGAA
Illuminaシステム用Index 706プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAATTCGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GAATTCGT
Illuminaシステム用Index 707プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTTCAGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CTGAAGCT
Illuminaシステム用Index 708プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCATTAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAATGCGC
Illuminaシステム用Index 709プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAGCCGGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGGCTATG
Illuminaシステム用Index 710プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGCGGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCCGCGAA
Illuminaシステム用Index 711プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCGAGAGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TCTCGCGC
Illuminaシステム用Index 712プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATCGCTGTGACTG- GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	AGCGATAG

-s-はホスホロチオエート結合を示しています。

IV. PCR反応の設定

1. Index 7プライマーとIndex 5プライマーの有効な組み合わせになっていることを確認してください。正しいプライマーが選択されているかどうかの確認は、セクションIとIIを参照してください。
2. 各PCRチューブには、Index 5プライマー (º) (5 µL) とIndex 7プライマー (•) (5 µL) を、それぞれ1種類のみを加えてください。クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。必要に応じて、元のIndex 5の白キャップ、またはIndex 7のオレンジキャップは破棄し、新しいキャップを使用してクロスコンタミネーションを回避してください。
3. 各PCRチューブに加えたIndex 5プライマーおよびIndex 7プライマーを記録してください。
4. Q5 PCR Master Mix (•) 25 µLを、プライマーを含む各チューブに加えてください。
5. アダプターを結合させたDNA 15 µLを、最終容量50 µLになるように対応するチューブに加えてください。ピペッティングで5–10回穏やかに上下させて、混合してください。クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。
6. PCRチューブに、加えたDNAサンプル (アダプターを結合させたDNA) を記録してください。
7. PCRチューブをスピンダウンし、推奨のサイクル条件に従ってPCRを実行してください (ChIP-DNAまたはCUT&RUNに用いるDNAの初期サンプル量については、DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795のプロトコールを参照してください)。
   

参考：キット構成品の品質管理

Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538の構成品は、以下に記載された機能試験を用いて検証されており、厳格な品質管理基準を満たしています。さらに、インデックス化されたライブラリーの調製およびシーケンシング解析を行い、Illuminaシステムシーケンシングプラットフォームで構成品の各セットが機能することを確認しています。

I. Adaptor for Illumina Systems (15 µM) (•)

5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

品質管理アッセイ

1. 16時間のインキュベーション：本アダプターとHindIIIで消化したLambda DNA 1 µgを含む反応液50 µLを、37°Cで16時間インキュベートした場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。1X濃度の反応バッファーとT3 DNA 1 µgを含む反応液50 µLを37°Cで16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エンドヌクレアーゼ活性：本アダプターの少なくとも5 µLをφX174 RF 1 DNA 1 µgと混合し、37°Cで4時間インキュベートした場合に (反応液50 µL)、アガロースゲル電気泳動で検出可能なRF IIへの変換は<10%です。
3. ホスファターゼ活性：本アダプターの少なくとも10 µLを2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateと混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。
4. RNase活性：本アダプターとFAMラベルしたRNA転写物40 ngを混合してインキュベート (37°C、16時間) した場合に、ポリアクリルアミド電気泳動で検出可能なRNase活性はみられません。

II. ユーザー酵素(•)

溶液組成：50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 µg/mL BSA、50% Glycerol

品質管理アッセイ

1. 非特異的DNase活性 (16時間)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットをLambda DNA 1 µgと混合し、50 µLのNEBuffer 1中でインキュベート (37°C、16時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼ活性はみられません。Endonuclease VIIIの少なくとも25ユニットをLambda-HindIII DNA 1 µgと混合し、Endonuclease VIII反応バッファー50 µL中でインキュベート (37°C、16時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エキソヌクレアーゼ活性 (放射線の放出)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットを [³H] ラベルした単鎖および二本鎖E. coli DNAの混合物1 µgと混合し、50 µLのNEBuffer 1 反応液中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に放出される放射線は、全放射線の<0.1%です。Endonuclease VIIIの少なくとも10ユニットを単鎖および二重鎖 [³H] ラベルした単鎖および二本鎖E. coli DNAの混合物1 µgと混合し、50 µLのEndonuclease VIII反応バッファー中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に放出される放射線は、全放射線の<0.5%です。
3. エンドヌクレアーゼ活性 (ニッキング)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットをスーパーコイルφX174 DNA 1 µgと混合し、50 µLのUDG反応バッファー中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なニック型への変換は<10%です。
4. ホスファターゼ活性：1X濃度のUSERの少なくとも10 µLを2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateと混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート (37°、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。

III. Illuminaシステム用のIndex 5プライマーおよびIndex 7プライマー (10 µM) (º•)

品質管理アッセイ

1. 16時間のインキュベーション：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 µLとHindIII消化したLambda DNA 1 µgを含む反応液50 µLを、37°Cで16時間インキュベートした場合に、アガロースゲル電気泳動により検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。Index [X] Primer for Illumina SystemsとT3 DNA 1 µgを含む反応液50 µLを、37°Cで16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動により検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エンドヌクレアーゼ活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 µLとφX174 RF IスーパーコイルDNA 1 µgを混合し、37°Cで4時間インキュベートした場合に (反応液50 µL)、アガロースゲル電気泳動により検出されるRF II (ニック分子) への変換は10%未満です。
3. RNase活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 µLとRNA転写物40 ngを混合し、37°Cで16時間インキュベートした場合に (反応液10 µL)、ゲル電気泳動により検出可能なRNA分解はみられません。
4. ホスファターゼ活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマーと2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateを混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート(37°C、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。