Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)　プロトコール

次世代シーケンシング (NG-seq) は、クロマチン免疫沈降 (ChIP) やCUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) アッセイの下流で使用可能なハイスループット解析であり、ゲノム全体にわたる標的DNAの濃縮の特定や定量に用いられます。Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) には、Illuminaシステムプラットフォーム (Illumina, Inc.) でNG-seq解析を行うために必要な、マルチプレックスサンプルの調製に最適なアダプターとプライマーが含まれています。このキットは、ChIP-seqまたはCUT&RUN用の最大12種類の異なるバーコード標識をもつDNAライブラリーを調製できます。これらのライブラリーは、まとめて1回のシーケンシング反応で解析できます。

各キットの構成品は、厳格な品質管理基準を満たしています。また、新ロットごとに、キット一式をIlluminaシステムシーケンシングプラットフォーム上でのインデックスライブラリーの構築およびシーケンシングで検証してます。

この製品には、最大24種類のバーコード標識をもつDNAシーケンシングライブラリーを調製するのに十分な量の試薬が含まれます。この製品はDNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795と組み合わせて使用する必要があります。

適合するアッセイキット：

SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
CUT&RUN Assay Kit #86652
CUT&RUN Assay Kit (with Drosophila Spike-In Control) #84647

適合しないアッセイキット：

CUT&Tag Assay Kit #77552
SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
注意：アガロースビーズは、ソニケートされたサケ精子DNAでブロッキングされており、これは、DNAライブラリーやNG-seqに混入する恐れがあります。

必要な試薬：
キットに含まれる試薬：

1. • (赤) Adaptor for Illumina Systems #42436
2. • (赤) USER Enzyme #59713
3. • (青) Universal PCR Primer for Illumina Systems #12078
4. • (青) Index 1 Primer for Illumina_^® #28248
5. • (青) Index 2 Primer for Illumina Systems #41836
6. • (青) Index 3 Primer for Illumina Systems #64036
7. • (青) Index 4 Primer for Illumina Systems #83765
8. • (青) Index 5 Primer for Illumina Systems #18392
9. • (青) Index 6 Primer for Illumina Systems #27180
10. • (青) Index 7 Primer for Illumina Systems #43985
11. • (青) Index 8 Primer for Illumina Systems #68962
12. • (青) Index 9 Primer for Illumina Systems #83219
13. • (青) Index 10 Primer for Illumina Systems #90275
14. • (青) Index 11 Primer for Illumina Systems #28019
15. • (青) Index 12 Primer for Illumina Systems #39090

キットに含まれない試薬：

1. ChIPまたはCUT&RUN Illumina Systems NG-seqライブラリー調製に適した酵素とバッファー：DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795に含まれています。
2. Nuclease-free Water #12931
3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
4. 用時調製した80%エタノール
5. 1X TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)
6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5)
7. Magnetic Separation Rack #7017/#14654
8. Agilent BioanalyzerまたはTapeStationシステム (Agilent Technologies, Inc.)
9. PCRチューブとPCR装置

I. ロープレックスでサンプルをプールする場合のガイドライン：

IlluminaシステムのNG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスに赤色レーザー/LEDを、G/Tのシーケンスに緑色レーザー/LEDを使用しています。サイクルごとに赤と緑の両方のチャンネルで読み取り、これらを用いて画像の正確なレジストレーションを行います (すなわち、各サイクルでAかCのいずれかと、GかTのいずれかが存在する必要があります)。インデックスリードのシーケンシングの際にこのカラーバランスが保たれていない場合、解析が失敗する可能性があります。各サイクルで赤と緑の両方のシグナルが確実に得られる設定になっているか、各インデックス配列を確認してください。以下の例を参照してください：

Illuminaシステム用Index 7プライマー		Illuminaシステム用Index 5プライマー
Illuminaシステム用Index 1プライマー	ATCACG	Illuminaシステム用Index 1プライマー	ATCACG
Illuminaシステム用Index 2プライマー	CGATGT	Illuminaシステム用Index 2プライマー	CGATGT
Illuminaシステム用Index 4プライマー	TGACCA	Illuminaシステム用Index 3プライマー	TTAGGC
Illuminaシステム用Index 7プライマー	CAGATC	Illuminaシステム用Index 4プライマー	TGACCA
	✔✔✔✔✔✔		✔✘✘✔✔✔

下の表は、一緒にシーケンスできる有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) をリスト化したものです。

2サンプルのプール	Index 6、Index 12プライマー
3サンプルのプール	Index 4、Index 6、Index 12プライマー
6サンプルのプール	Index 2、Index 4、Index 5、Index 6、Index 7、Index 12プライマー

Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) は、各インデックスプライマーをIlluminaシステム用のユニバーサルPCRプライマーと組み合わせて一度のみ使用することにより、バーコードを付加したライブラリーを12種類調製できます。各インデックスプライマーには2回分のライブラリー調製に十分な量が含まれますが、同じインデックスプライマーを用いたライブラリーを一度のシーケンシング反応で同時解析することはできません。

1プレックス (プールなし) で解析を行う場合は、いずれかのインデックスプライマーをユニバーサルPCRプライマーと組み合わせて使用してください。

II. Illuminaシステム用のIndex 1-12プライマー：

Illuminaシステム用の各インデックスプライマーは、10 µLの容量で提供されています。

Illuminaシステム用Index 1プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ATCACG
Illuminaシステム用Index 2プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CGATGT
Illuminaシステム用Index 3プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGA- GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TTAGGC
Illuminaシステム用Index 4プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGA- GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TGACCA
Illuminaシステム用Index 5プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGA- GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ACAGTG
Illuminaシステム用Index 6プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GCCAAT
Illuminaシステム用Index 7プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CAGATC
Illuminaシステム用Index 8プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	ACTTGA
Illuminaシステム用Index 9プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GATCAG
Illuminaシステム用Index 10プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	TAGCTT
Illuminaシステム用Index 11プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGA- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	GGCTAC
Illuminaシステム用Index 12プライマー	5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAG- TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´	CTTGTA

-s-はホスホロチオエート結合を示しています。

III. PCR反応の設定

1. 有効な組み合わせのインデックスプライマーを使用していることを確認してください。正しいプライマーが選択されているかどうかの確認は、セクションIとIIを参照してください。
2. 各PCRチューブに、いずれか1種類のインデックスプライマー (•) 5 µLと、ユニバーサルPCRプライマー (•) 5 µLを加えてください。クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。
3. 各PCRチューブに加えたインデックスプライマーを記録してください。
4. Q5 PCR Master Mix (•) 25 µLを、プライマーを含む各チューブに加えてください。
5. アダプターを結合させた DNA 15 µLを、最終容量50 µLになるように対応するチューブに加えてください。ピペッティングで5–10回穏やかに上下させて、混合してください。クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。
6. PCRチューブに、加えたDNAサンプル (アダプターを結合させたDNA) を記録してください。
7. PCRチューブをスピンダウンし、推奨のサイクル条件に従ってPCRを実行してください (ChIP-DNAまたはCUT&RUNに用いるDNAの初期サンプル量については、DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795のプロトコールを参照してください)。

参考：キット構成品の品質管理

Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580の構成品は、以下に記載された機能試験を用いて検証されており、厳格な品質管理基準を満たしています。さらに、インデックス化されたライブラリーの調製およびシーケンシング解析を行い、Illuminaシステムシーケンシングプラットフォームで構成品の各セットが機能することを確認しています。

I. Adaptor for Illumina Systems (15 μM) (•)

5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

品質管理アッセイ

1. 16時間のインキュベーション：本アダプターとHindIIIで消化したLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37°Cで16時間インキュベートした場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。1X濃度の反応バッファーとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを37°Cで16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エンドヌクレアーゼ活性：本アダプターの少なくとも5 μLをφX174 RF 1 DNA 1 μgと混合し、37°Cで4時間インキュベートした場合に (反応液50 μL)、アガロースゲル電気泳動で検出可能なRF IIへの変換は<10%です。
3. ホスファターゼ活性：本アダプターの少なくとも10 μLを2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateと混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。
4. RNase活性：本アダプターとFAMラベルしたRNA転写物40 ngを混合してインキュベート (37°C、16時間) した場合に、ポリアクリルアミド電気泳動で検出可能なRNase活性はみられません。

II. ユーザー酵素(•)

溶液組成：50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 μg/mL BSA、50% Glycerol

品質管理アッセイ

1. 非特異的DNase活性 (16時間)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットをLambda DNA 1 μgと混合し、50 μLのNEBuffer 1中でインキュベート (37°C、16時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼ活性はみられません。Endonuclease VIIIの少なくとも25ユニットをLambda-HindIII DNA 1 μgと混合し、Endonuclease VIII反応バッファー50 μL中でインキュベート (37°C、16時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エキソヌクレアーゼ活性 (放射線の放出)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットを [³H] ラベルした単鎖および二本鎖E. coli DNAの混合物1 μgと混合し、50 μLのNEBuffer 1 反応液中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に放出される放射線は、全放射線の<0.1%です。Endonuclease VIIIの少なくとも10ユニットを単鎖および二重鎖 [³H] ラベルした単鎖および二本鎖E. coli DNAの混合物1 μgと混合し、50 μLのEndonuclease VIII反応バッファー中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に放出される放射線は、全放射線の<0.5%です。
3. エンドヌクレアーゼ活性 (ニッキング)：Uracil DNA Glycosylaseの少なくとも50ユニットをスーパーコイルφX174 DNA 1 μgと混合し、50 μLのUDG反応バッファー中でインキュベート (37°C、4時間) した場合に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なニック型への変換は<10%です。
4. ホスファターゼ活性：1X濃度のUSER Enzymeの少なくとも10 μLを2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateと混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート (37°C、4時間) した場合、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。

III. Universal PCR Primer for Illumina Systems (10 μM) (•)

5´-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC*T-3´

品質管理アッセイ

1. 16時間のインキュベーション：本プライマーとHindIIIで消化したLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37°Cで16時間インキュベートした場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。プライマー1 μLとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37°Cで16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エンドヌクレアーゼ活性：本プライマーの少なくとも5 μLをφX174 RF 1 DNA 1 μgと混合してインキュベート (37°C、4時間) した場合に (反応液50 μL)、アガロースゲル電気泳動により検出されるRF IIへの変換は<10%です。
3. RNase活性：プライマー1 μLとFAMラベルしたRNA転写物40 ngを混合してインキュベート (37°C、16時間) した場合に、ポリアクリルアミド電気泳動で検出可能なRNase活性はみられません。
4. ホスファターゼ活性：本プライマーの少なくとも10 μLを2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateと混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート (37°、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。

IV. Index 1-12 Primers for Illumina Systems (10 μM) (•)

品質管理アッセイ

1. 16時間のインキュベーション：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 μLとHindIII消化したLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37°Cで16時間インキュベートした場合に、アガロースゲル電気泳動により検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。Index [X] Primer for Illumina SystemsとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLを、37°Cで16時間インキュベートした場合も同様に、アガロースゲル電気泳動により検出可能な非特異的なヌクレアーゼによる分解はみられません。
2. エンドヌクレアーゼ活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 μLとφX174 RF IスーパーコイルDNA 1 μgを混合し、37°Cで4時間インキュベートした場合に (反応液50 μL)、アガロースゲル電気泳動により検出されるRF II (ニック分子) への変換は10%未満です。
3. RNase活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマー1 μLとRNA転写物40 ngを混合し、37°Cで16時間インキュベートした場合に (反応液10 μL)、ゲル電気泳動により検出可能なRNA分解はみられません。
4. ホスファターゼ活性：Illuminaシステム用のIndex [X] プライマーと2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateを混合し、タンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl₂) 中でインキュベート(37°C、4時間) した場合に、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はみられません。