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DNA Library Prep Kit for Illumina プロトコール (ChIP-seq, CUT&RUN)

次世代シーケンシング (NG-seq) は、クロマチン免疫沈降 (ChIP) やCUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) アッセイのデータを利用し、領域の特定やゲノム全体における標的DNAの定量などのハイスループット解析に用いられます。DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) には、Illuminaプラットフォームで行う次世代シーケンシングに用いる、ChIP DNAまたはCUT&RUN DNAからの高品質なDNAシーケンシングライブラリーの調製に必要な酵素やバッファーがすべて含まれています。迅速でわかりやすいワークフローにより、DNAライブラリーの作成と精製に必要な作業時間を短縮することができます。

各キットの構成品は、厳密な品質管理基準を満たしています。新しいロットは、キット全体を用いてIlluminaシーケンシングプラットフォームでのインデックスライブラリーの構築およびシーケンシングにより検証されています。

この製品は、Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580、またはMultiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538と一緒に使用する必要があります。24回分の試薬が含まれており、酵素やソニケーションにより断片化したChIP濃縮DNAとCUT&RUN DNA (ChIPまたはCUT&RUNアッセイにより異なるプロトコールを用いて濃縮されたDNAを含む) のどちらも使用できます。

適合するアッセイキット：

  • CUT&RUN Assay Kit #86652
  • SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
  • SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
  • SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #56383

適合しないアッセイキット：

注意： アガロースビーズはソニケーションされたサケ精子DNAでブロッキングされており、DNAライブラリーやNG-seqに混入します。

  • SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
  • SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004

DNAライブラリーの調製に必要なその他の製品：

  • Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580
  • または
  • Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538

必要な試薬
キットに含まれている試薬：

  1. • (緑) End Prep Enzyme Mix #73416
  2. • (緑) End Prep Reaction Buffer #93209
  3. • (赤) Ligation Master Mix #46719
  4. • (赤) Ligation Enhancer #30147
  5. • (青) Q5 PCR Master Mix (2X) #67488

キットに含まれない試薬：

  1. Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 またはMultiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 80%エタノール (用事調製)
  5. 1X TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
  7. 磁気ラック/スタンド
  8. BioanalyzerとAgilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCRチューブとPCR機器

ChIP DNA用のDNA Library Prep Kit for Illuminaプロトコール

CUT&RUN DNAを用いたDNAライブラリーの調製については、CUT&RUNセクションのプロトコールへお進みください。

SAFE STOP  これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 

I. 準備

ChIP-seqを行う際、ChIPアッセイとDNAライブラリー調製によるDNA濃縮の実験的バイアスの確認のため、コントロールDNAシーケンシングライブラリーを調製する必要があります。インプットクロマチンから精製されたDNA (すなわち、IP用に使用されたクロマチン) は、通常はコントロールDNAライブラリーの調製に使用されます。

サンプルの準備： 500 pg –1 μgのChIP DNA。DNAシーケンシングライブラリーの適切な多様性を確保するため、転写因子または転写コファクターのChIP-seqにはChIPで濃縮されたDNA 5 ngを、Totalヒストンまたはヒストン修飾のChIP-seqにはChIPで濃縮されたDNA 50 ngを、コントロールDNAシーケンシングライブラリーにはインプットDNA 50 ngを使用することを推奨します。必要に応じて、ChIPで濃縮されたDNAは5 ng以下でもライブラリー調製に使用することができますが、PCRの増幅によるバイアスによって、ライブラリーの多様性が低下する場合があります。

実験開始前の準備：

  • End Prep Enzyme Mix (•) を室温で解凍してください。
  • 1X TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) を調製してください。
  1. 滅菌したヌクレアーゼフリーチューブに、ChIP DNA 0.5-50 ngと比較のためインプットDNA (コントロールDNA) を準備してください。各DNAサンプルの最終容量が50 μLになるように1X TEを加えてください。
  2. End Prep Enzyme Mix (•) 3 μLとEnd Prep Reaction Buffer (•) 7 μLを、各DNAサンプルに加えて、総反応容量が60 μLになるようにしてください。
  3. ピペッティングを少なくとも10回繰り返して反応液を良く混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. サーマルサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行してください：
    • 30 min、20 °C
    • 30 min、65 °C
    • 保持、4 °C
  5. アダプターライゲーション (セクションII) へと進んでください。必要に応じて、サンプルは-20℃で保存できますが、収量の低下 (-20%) がみられる可能性があります。プロトコールを中断する前に、アダプターライゲーションまで終わらせることを推奨します。

II. アダプターライゲーション

実験開始前の準備：

  • Adaptor for Illumina (•) とUSER enzyme (•) は、どちらもMultiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538に含まれています。
  • Adaptor for Illumina (•) を室温で解凍してください。
  • ピペッティングを2、3回繰り返し、ライゲーションマスターミックスを混ぜ合わせてください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を2.5 μL調製してください。
  1. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) でAdaptor for Illumina (•) を希釈してください。もし開始時のDNA量が5 ngから100 ngの場合は、アダプターを1:10に希釈して、ワーキング濃度が1.5 mMになるようにしてください。開始時のDNA量が5 ngより少ない場合は、アダプターを1:25に希釈して、ワーキング濃度が0.6 mMになるようにしてください。
  2. Ligation Master Mix (•) 30 μL、Ligation Enhancer (•) 1 μL、希釈したAdaptor for Illumina 2.5 μLを、セクションIステップ5のEnd Prep Reaction Mixture 60 μLに直接加えてください。
    注意： アダプターを含む反応用のプレミックス溶液を事前に希釈・調製しておくことは推奨しません。
  3. ピペッティングを10回以上繰り返してライゲーション反応液を十分に​混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。Ligation Master Mixは非常に粘性があります。混合が不完全な場合、ライゲーション効率が低下するため、ライゲーション反応液は十分に混ぜ合わせてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. 室温で15分間インキュベートしてください。
  5. USER Enzyme (•) 3 μLをライゲーション反応液に加えてください。よく混ぜ合わせた後、ヒートリッドを47℃以上に設定し、37℃で15分間インキュベートしてください。
  6. アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップ (セクション III) へと進んでください。(SAFE STOP) サンプルを‐20℃で保存することができます。

III. サイズ選択をしない、アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップ

ChIP-seq DNAライブラリーの収量と多様性が大きく損なわれるため、アダプターライゲーション済みChIP DNAのクリーンアップの段階でのサイズ選択は推奨しません。

実験開始前の準備：

  • AMPure XP ビーズを使用する場合、室温に戻るよう使用前に少なくとも30分間は室温に置いてください。
  • チューブの転倒混和またはピペッティングにより、AMPure XP BeadsまたはSPRIselectビーズを再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) を17 μL用意してください。
  1. 再懸濁したAMPure XP Beads、またはSPRIselectビーズ 87 μL (0.9X) を各アダプターライゲーション反応液に加えてください。10回以上ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、最後の混合は注意深く行ってください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 溶液が透明になったら、注意深く上清を取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗ってください。2回目の洗浄後、目に見えるすべての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
    注意： ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) 17 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを5分間置いてください。溶液が透明になったら、DNA標的を含む上清15 μLを新しいPCRチューブに移してください。アダプターライゲーション済みChIP-DNAのPCR濃縮 (セクション IV) へと進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

IV. アダプターライゲーション済みChIP DNAのPCR濃縮

実験開始前の準備：

  • Universal PCR Primer for Illumina (•) と12種類のIndex Primer for Illumina (•) は、Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580に含まれています。Single Index Primers (#29580) を使用する際は、PCR反応毎にインデックスプライマー1つのみを使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#29580のデータシートをご確認ください。
  • 8種類のIndex 5​ Primer for Illumina (白色のキャップ) と、12種類のIndex 7​ Primer for Illumina (オレンジ色のキャップ) は、Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538に含まれています。Dual Index Primers (#47538) と使用するには、反応毎に、Index 5​ Primer 1つとIndex 7​ Primer 1つのみを使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#47538のデータシートをご確認ください。
  • プライマーと精製済みのアダプターライゲーション済みChIP DNA断片 (セクションIIIステップ9から) を室温で解凍してください。
  1. 以下の構成品を滅菌処理したPCRチューブに加えてください：
    試薬 PCR反応1回分の必要量 (50 μＬ)
    精製したアダプターライゲーション済みChIP-DNA断片 (セクションIIIのステップ9から) 15 μL
    Q5 PCR Master Mix (•) 25 μL
    Single Index Primer for Illumina (•) (もしくはDual Index用のDual Index 7 Primer for Illumina® [オレンジ色のキャップ]) 5 μL
    Universal PCR Primer for Illumina (•) (もしくはDual Index用Dual Index 5 Primer for Illumina [白色のキャップ]) 5 μL
  2. ピペッティングを10回繰り返して反応液を十分に混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。
  3. チューブをサーマルサイクラーにセットし、以下のPCRサイクル条件でPCR増幅をおこなってください。
    a. 初期変性 98°C、30秒間
    b. 変性 98°C、10秒間
    c. アニーリングおよび伸長 65°C、15秒間
    d.

    出発材料が​50 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計6回繰り返してください。
    出発材料が​5 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計10回繰り返してください。
    出発材料が​0.5 ngのChIP DNAの場合、Step bとStep cを合計13回繰り返してください。
    e. 最終伸長反応 65°C、3分間
    f. 保持 (Hold) 4℃
  4. PCR増幅産物のクリーンアップ (セクションV) に進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

V. PCR増幅産物のクリーンアップ

実験開始前の準備：

  • AMPure XP ビーズを使用する場合、室温に戻るよう使用前に少なくとも30分間は室温に置いてください。
  • チューブの転倒混和またはピペッティングにより、AMPure XP BeadsまたはSPRIselectビーズを再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を40 μL調製してください。
  1. 再懸濁したAMPureビーズ 45 μL (0.9X)、またはSPRIselectビーズを、セクションIV、ステップ​4からのPCR反応液 50 μLへと加えてください。10回以上ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、最後の混合は注意深く行ってください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 上清を注意深く除去して捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。2回目の洗浄後、目に見えるすべての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
    注意： ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) 33 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを5分間置いてください。注意深く、DNA標的を含む上清 30 μLを新しいチューブへ移してください。(SAFE STOP) ライブラリは-20℃で保存できます。
  10. NanodropまたはPicogreenアッセイで、ライブラリーDNAの濃度を測定してください。DNAライブラリー濃度は10-40 ng/μLの範囲内である必要があります。
  11. ライブラリーDNA 1 μLを10 mM Tris-HClで、最終濃度が5-10 ng/μLになるように希釈してください。Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA チップを使用し、メーカーの指示に従って、希釈済みライブラリーDNAのサイズ分布を解析してください。
  12. アダプターダイマー (Single Index Primersではおよそ128 bp、もしくはDual Index Primersではおよそ146 bp) のコンタミネーションが観察された場合は、クリーンアップステップの1-10を繰り返してください。残留しているアダプターやアダプターダイマーは、シーケンシング反応に混入し著しい影響を与えます。
  13. ハイスループットシーケンシング用に、10 mM Tris-HClで最終的な精製ライブラリーサンプルを希釈してください。NG-seqに必要なライブラリーDNAの最適濃度と容量については、Illuminaのシーケンシングマニュアルを参照してください。

CUT&RUN DNA用のDNA Library Prep Kit for Illumina プロトコール

SAFE STOP  これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。 

I. 準備

CUT&RUN-seqを行う際、ChIPアッセイとDNAライブラリー調製によるDNA濃縮の実験的バイアスの確認のため、コントロールDNAシーケンシングライブラリーを調製する必要があります。インプットDNAから精製されたDNA (CUT&RUN Assay Kit #86652 プロトコールのセクションV) は、通常はコントロールDNAライブラリーの調製に使用されます。

サンプルの準備： 0.5 ng–1 µgのCUT&RUN DNA。１回の反応で得られるCUT&RUN DNAの一般的な収量は、100,000細胞あたり0.6から6 ngです。DNAシーケンシングライブラリーの最適な多様性を確保するため、1回のCUT&RUN反応から得られる量と同量のCUT&RUN DNAの使用をお勧めします。CUT&RUN DNAはわずか0.1 ngでもライブラリー調製に使用できますが、PCRの増幅によるバイアスによって、ライブラリーの多様性が低下する場合があります。インプットDNAを使用したコントロールDNAシーケンシングライブラリーの場合、5 - 10 ngから実験を始めることをお勧めします。なお、CUT&RUN DNAの濃度を測定するためには、Nanodropだけでは十分な感度が得られないため、Picogreenアッセイを行う必要があることにご注意ください。

実験開始前の準備：

  • End Prep Reaction Buffer #93209 (•) を室温で解凍してください。DTTが沈殿していたらボルテックスしてください。
  • 1X TE (10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) を調製してください。
  1. CUT&RUN DNA0.5-10 ngとインプットDNA (コントロールDNA) を、別々の滅菌したヌクレアーゼフリーチューブに準備してください。各DNAサンプルの最終容量が50 μLになるように1X TEを加えてください。
  2. End Prep Enzyme Mix (•) 3 μLとEnd Prep Reaction Buffer (•) 7 μLを各DNAサンプルに加えて、総反応容量を60 μLにしてください。
  3. ピペッティングを少なくとも10回繰り返して反応液を良く混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. サーマルサイクラーにセットし、以下のプログラムを実行してください：
    • 30 min、20 °C
    • 30 min、50 °C
    • 保持、4 °C
  5. アダプターライゲーション (セクションII) へと進んでください。必要に応じて、サンプルは-20℃で保存できますが、収量の低下 (-20%) がみられる可能性があります。プロトコールを中断する前に、アダプターライゲーションまで終わらせることを推奨します。

II. アダプターライゲーション

実験開始前の準備：

  • Adaptor for Illumina ( •) とUSER enzyme (•) は、どちらもMultiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538に含まれています。
  • Adaptor for Illumina ( •) を室温で解凍してください。
  • ピペッティングを2、3回繰り返し、ライゲーションマスターミックスを混ぜ合わせてください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を2.5 μL調製してください。
  1. 過剰なアダプターによるライブラリーDNAのコンタミネーションを避けるため、下の表を参考にしながらAdaptor for Illumina ( •) を 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) で希釈してください。
    開始DNA アダプター希釈率 機能するアダプター濃度
    100 ng - 1 μg 希釈なし 15 μM
    5 ng - 100 ng 1：10 1.5 μM
    2.5 ng - 5 ng 1：25 0.6 μM
    1.25 ng - 2.5 ng 1:50 0.3 μM
    1.25 ng未満 1：125 0.12 μM
  2. Ligation Master Mix (•) 30 μL、Ligation Enhancer (•) 1 μL、希釈したAdaptor for Illumina 2.5μLを、セクションIステップ5のEnd Prep Reaction Mixture 60 μLに直接加えてください。
    注意： アダプターを含む反応用のプレミックス溶液を事前に希釈・調製しておくことは推奨しません。ただし、Ligation Master MixとLigation Enhancerのプレミックスは、4°Cで静置し、静置時間が8時間未満である場合には許容されます。
  3. ピペッティングを10回以上繰り返してライゲーション反応液を十分に​混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。Ligation Master Mixは非常に粘性があります。混合が不完全な場合、ライゲーション効率が低下するため、ライゲーション反応液は十分に混ぜ合わせてください。少量の気泡があっても、パフォーマンスにはそれほど影響しません。
  4. 少なくとも15分間、室温でインキュベートしてください。
  5. USER Enzyme ( •) 3 μLをライゲーション反応液に加えてください。よく混ぜ合わせた後、ヒートリッドを47℃以上に設定し、37℃で15分間インキュベートしてください。
  6. アダプターライゲーション済みCUT&RUN DNAのクリーンアップ (セクション III) へと進んでください。(SAFE STOP) サンプルを‐20℃で保存することができます。

III. サイズを選択しないアダプターライゲーション済みCUT&RUNのクリーンアップ

DNAライブラリーの収量と多様性が大きく損なわれるため、アダプターライゲーション済みCUT&RUN DNAのクリーンアップ段階でのサイズ選択は推奨しません。

実験開始前の準備：

  • AMPure XP ビーズを使用する場合、室温に戻るよう使用前に少なくとも30分間は室温に置いてください。
  • チューブの転倒混和またはピペッティングにより、AMPure XP BeadsまたはSPRIselectビーズを再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) を17 μL用意してください。
  1. 再懸濁したAMPure XP Beads、またはSPRIselectビーズ 106 μL (1.1X) を各アダプターライゲーショ反応液に加えてください。10回以上ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、最後の混合は注意深く行ってください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 溶液が透明になったら、注意深く上清を取り除いて捨ててください。標的のDNAを含むビーズを乱さないように注意しながら、残った液体をすべて除去してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗ってください。2回目の洗浄後、目に見えるすべての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
    注意： ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) 17 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを5分間置いてください。溶液が透明になったら、DNA標的を含む上清15 μLを新しいPCRチューブに移してください。アダプターライゲーション済みChIP-DNAのPCR濃縮 (セクション IV) へと進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

IV. アダプターライゲーション済みCUT&RUN DNAのPCR濃縮

実験開始前の準備：

  • Universal PCR Primer for Illumina (•) と12種類のIndex Primer for Illumina (•) は、Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580に含まれています。Single Index Primers (#29580) を使用する際は、PCR反応毎にインデックスプライマー1つのみを使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#29580のデータシートをご確認ください。
  • 8種類のIndex 5​ Primer for Illumina (白色のキャップ) と、12種類のIndex 7​ Primer for Illumina (オレンジ色のキャップ) は、Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538に含まれています。Dual Index Primers (#47538) と使用するには、反応毎に、Index 5​ Primer 1つとIndex 7​ Primer 1つのみを使用してください。有効なバーコードの組み合わせとPCR反応のためのヒントは、#47538のデータシートをご確認ください。
  • プライマーと精製済みのアダプターライゲーション済みCUT&RUN DNA断片 (セクションIIIステップ9から) を室温で解凍してください。
  1. 以下の構成品を滅菌処理したPCRチューブに加えてください：
    試薬 PCR反応1回分の必要量 (50 μＬ)
    精製したアダプターライゲーション済みCUT&RUN DNA断片 (セクションIIIのステップ9から) 15 μL
    Q5 PCR Master Mix ( •) 25 μL
    Single Index Primer for Illumina (•) (もしくはDual Index用のDual Index 7 Primer for Illumina [オレンジ色のキャップ]) 5 μL
    Universal PCR Primer for Illumina (•) (もしくはDual Index用Dual Index 5 Primer for Illumina [白色のキャップ]) 5 μL
  2. ピペッティングを10回繰り返して反応液を十分に混合し、スピンダウンしてチューブ側面の液体をすべて落としてください。
  3. チューブをサーマルサイクラーにセットし、以下のPCRサイクル条件でPCR増幅をおこなってください。
    a. 初期変性 98°C、30秒間
    b. 変性 98°C、10秒間
    c. アニーリングおよび伸長 65°C、13秒間
    d. CUT&RUNの開始DNA50 - 100 ngの場合 ステップb - cの繰り返し (合計6 - 7サイクル)
    CUT&RUNの開始DNA5 - 50 ngの場合 ステップb - cの繰り返し (合計8 - 12サイクル)
    CUT&RUNの開始DNA 1 - 5 ngの場合 ステップb - cの繰り返し (合計13 - 15サイクル)
    CUT&RUNの開始DNA 0.5 - 1 ngの場合 ステップb - cの繰り返し (合計16 - 17サイクル)
    CUT&RUNの開始DNA0.2 - 0.5 ngの場合 ステップb - cの繰り返し (合計18 - 19サイクル)
    CUT&RUNの開始DNA0.1 - 0.2 ngの場合 ステップb - cを繰り返し、計20サイクル反応させてください
    e. 最終伸長反応 65°C、3分間
    f. 保持 (Hold) 4℃

     

  4. PCR増幅産物のクリーンアップ (セクションV) に進んでください。(SAFE STOP) もしくは、サンプルを‐20℃で保存してください。

V. PCR増幅産物のクリーンアップ

実験開始前の準備：

  • AMPure XP ビーズを使用する場合、室温に戻るよう使用前に少なくとも30分間は室温に置いてください。
  • チューブの転倒混和またはピペッティングにより、AMPure XP BeadsまたはSPRIselectビーズを再懸濁してください。
  • 各サンプルに対して、80%エタノールを400 μL用意してください。
  • 各サンプルに対して、10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) を40 μL調製してください。
  1. 再懸濁したAMPureビーズ 50 μL (1.0X)、またはSPRIselectビーズを、セクションIV、ステップ​4からのPCR反応液 50 μLへと加えてください。10回以上ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、最後の混合は注意深く行ってください。
  2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
  3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
  4. 上清を注意深く除去して捨ててください。標的のDNAを含むビーズを乱さないように注意しながら、残った液体をすべて除去してください。
  5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく準備した80%エタノール200 μLをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
  6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。2回目の洗浄後、目に見えるすべての液体が取り除かれていることを確認してください。
  7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
    注意： ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。
  8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) 33 μLを加えることで、ビーズからDNA標的を溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
    注意： Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) の量を減らすことで (17 µLにするなど)、より高濃度のライブラリーDNAを得ることもできます。
  9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを5分間置いてください。注意深く、DNA標的を含む上清 30 μLを新しいチューブへ移してください。(SAFE STOP) ライブラリは-20℃で保存できます。
    注意： ステップ8で17 μLのTris-HCl (pH 8.0-8.5) を使用した場合は、DNAターゲットを含む上清15 μLのみを新しいチューブに移します。
  10. NanodropまたはPicogreenアッセイで、ライブラリーDNAの濃度を測定してください。DNAライブラリー濃度は10-40 ng/μLの範囲内である必要があります。
  11. ライブラリーDNA 1 μLを10 mM Tris-HClで、最終濃度が5-10 ng/μLになるように希釈してください。Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA チップを使用し、メーカーの指示に従って、希釈済みライブラリーDNAのサイズ分布を解析してください。
  12. アダプターダイマー (Single Index Primersではおよそ128 bp、もしくはDual Index Primersではおよそ146 bp) のコンタミネーションが観察された場合は、クリーンアップステップの1-10を繰り返してください。残留しているアダプターやアダプターダイマーは、シーケンシング反応に混入し著しい影響を与えます。
  13. ハイスループットシーケンシング用に、10 mM Tris-HClで最終的な精製ライブラリーサンプルを希釈してください。NG-seqに必要なライブラリーDNAの最適濃度と容量については、Illuminaのシーケンシングマニュアルを参照してください。

参考：キット構成品の品質管理

I. End Prep Enzyme Mix (•)

説明
End Prep Enzyme Mixは、断片化されたDNA 500 pg-1 μgから修復された5´-リン酸化、3´-dA-尾部末端を持つDNAへと転換するために最適化されています。

品質管理アッセイ

  1. SDS-PAGEでの純度：各酵素のSDS-PAGE解析により、 95%超の純度を確認しています。
  2. エンドヌクレアーゼ活性：酵素ミックス最低10 µLとφX174 RF 1 DNA 1 µgを50 µLの反応溶液になるようアッセイバッファー中で混合しインキュベート (37℃、4時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出されるRF IIへの変換は10%未満です。
  3. ホスファターゼ活性：2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateをタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8) と0.5 mM MgCl2) 中で酵素ミックス (最低10 μL) と混合しインキュベート (37℃、4時間)した場合、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionは産生されません。
  4. 機能活性 (ヌクレオチド取り込みやリン酸化、dA付加反応)：1X End Repair Reactionバッファー中の酵素ミックス 1 μLの処理 (25℃、20分間) による、3'と5'の両方のオーバーハングを含むDNA断片 0.5 μgの95%超の末端の修復およびリン酸化をキャピラリー電気泳動を用いて確かめています。

II. End Prep Reaction Buffer (•)

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション：1X 濃度の反応バッファーを含む反応液50 μLとHindIIIにより消化されたLambda DNA 1 μgをインキュベート (37℃、16時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。1X 濃度の反応バッファーを含む反応液50 μLとT3 DNA 1 μgをインキュベート (37℃、16時間) した場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能なレベルの非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性：1X 濃度の反応バッファーとφX174 RF I DNA 1 μgを50 μLの反応溶液になるよう調整しインキュベート (37℃、4時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能なRF IIへの変換は10%未満です。
  3. RNase活性：1X 濃度の反応バッファーとFAMラベルされたRNA転写物 40 ngをインキュベート (37℃、16時間) した場合、ポリアクリルアミド電気泳動により検出可能なRNase活性はありません。
  4. ホスファターゼ活性：1X濃度のリアクションバッファーと2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateをタンパク質 ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl2) 中で混合しインキュベート (37℃、4時間) した場合、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はありません。

III. Ligation Master Mix (•)

説明
Ligation Master Mixは、T4 DNAリガーゼ、CST独自のライゲーションエンハンサー、最適化済みの反応バッファーを含むready-to-useの溶液です。

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション：1X 濃度のLigation Master Mixを含む反応液50 μLとHindIIIにより消化されたLambda DNA 1 μgをインキュベート (37℃、16時間)した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。1X 濃度のLigation Master Mixを含む反応液50 μLとT3 DNA 1 μgをインキュベート (37℃、16時間) した場合も同様に、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性：1X 濃度の反応バッファーとφX174 RF I DNA 1 μgを50 μLの反応溶液になるよう調整しインキュベート (37℃、4時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出されるRF IIへの変換は10%未満です。
  3. RNase活性：1X 濃度のLigation Master MixとFAMラベルされたRNA転写物 40 ngをインキュベート (37℃、16時間) した場合、ポリアクリルアミド電気泳動で検出可能なRNase活性はありません。
  4. 形質転換アッセイ：LITMUS 28ベクターは、EcoRV切断 (平滑末端)後、CIP (calf intestinal phosphatase) 処理し、ゲル精製します。φX174 DNAのHaeIIIの消化による平滑末端化インサートは、Ligation Master Mixプロトコールにより3：1のインサート：ベクター比でベクターへと連結されます。ライゲーション製品は記載の通り形質転換されています。各ロットは以下の基準以上を満たしています：

効率 (形質転換体/µg)

  Recircularization Insertion
Blunt ends > 1 x 107 > 2.5 x 106
Uncut vector > 1 x 108 N/A

IV. Ligation Enhancer (•)

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション：Ligation Enhancer 1 μLとHindIII消化されたLambda DNA 1 μgを含む反応液50 μLをインキュベート (37℃、16時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。NEBNext 5´ SR Adaptor 3 1 μLとT3 DNA 1 μgを含む反応液50 μLをインキュベート (37℃、16時間) した場合にも、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. エンドヌクレアーゼ活性：Ligation Enhancer 1 μLとφX174 RF IスーパーコイルDNA 1 μgを50 μLの反応溶液になるよう調整しインキュベート (37℃、4時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能なRF II (ニック分子) への変換は10%未満です。
  3. RNase活性：Ligation Enhancer 1 μLを反応溶液10 μL中でRNA転写 40 ngと混合しインキュベート (37℃、16時間) した場合、ゲル電気泳動で検出可能なRNA分解はありません。
  4. ホスファターゼ活性：Ligation Enhancerと2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateをタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamin (pH 9.8)、0.5 mM MgCl2) 中で混合しインキュベート (37℃、4時間) した場合、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-nitrophenylene anionの産生はありません。

V. Q5 PCR Master Mix (2X) (•)

説明
Q5 PCR Master Mix (2X) は、GC含量に関わらず、次世代シーケンシング (NGS) ライブラリーの堅牢かつ忠実度の高い増幅のために特別に最適化されています。マスターミックスのポリメラーゼ構成因子である、Q5 High-Fidelity DNA Polymeraseは、3´→5´エキソヌクレアーゼ活性を持つ新しい耐熱性DNAポリメラーゼで、処理能力増強性のSso7dドメインに融合しています。またQ5は、非常に低いエラー率を示し、Taq DNAポリメラーゼと比較して100分の1未満、Pfu (Pyrococcus furiosus) DNAポリメラーゼと比較して約12分の1に抑えられています。マスターミックスのバッファー成分は、たとえGCリッチなアンプリコンでも堅牢な増幅を実現するために最適化されており、さらに通常のNGSワークフローで使用される様々なビーズにも対応しています。これらの特長は、Q5 PCR Master MixがNGSライブラリー調製に最適であることを示します。この便利な2X マスターミックスはdNTPs、Mg++、独自のバッファーを含み、あとはプライマーとDNAテンプレートを追加するだけで確実な増幅が得られます。ホットスタートアプタマーシステムを採用することにより、室温での反応液調製が可能になり、大変便利です。

品質管理アッセイ

  1. 16時間のインキュベーション：Q5 PCR Master Mixを含む反応液50 μLとHindIIIにより消化されたλ DNA 1 μgをインキュベート (37℃、16時間) した場合、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はみられません。Q5 PCR Master MixとT3 DNA 1 μgを含む反応溶液50 μLをインキュベート (37℃、16時間) した場合にも、アガロースゲル電気泳動で検出可能な非特異的ヌクレアーゼ分解はありません。
  2. ホスファターゼ活性：Q5 PCR Master Mixと2.5 mM p-Nitrophenyl phosphateをタンパク質ホスファターゼアッセイバッファー (1 M Diethanolamine (pH 9.8)、0.5 mM MgCl2 ) 中で混合しインキュベート (37℃、4時間) した場合、分光分析法 (405 nm) で検出可能なp-Nitrophenylene anionの産生はありません。
  3. 機能活性 (マルチプレックスPCR、ビーズ阻害)：0.5 μM 4-plex primer mixと1X Q5 PCR Master Mixを含む反応溶液50 μL中で、カルボキシル化磁気ビーズ有り、もしくは無しで20 ng ゲノムDNAのPCR増幅を30​サイクル行った場合、想定通り4種類の増幅産物が生じ、ビーズ存在下での増幅阻害はみられません。

更新：2022年6月

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