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フローサイトメトリー (メタノールによる透過化プロトコール)

重要： 製品ウェブページに記載の各製品専用フローサイトメトリープロトコールで、適切な固定および透過化の 条件、抗体の推奨希釈率を確認してください。

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593に 含まれています。下に記載されているカタログ 番号から個別にご購入いただくこともできます。

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または 同等の精製水で調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)：1X PBSを1 L調製する場合は、10X PBS ( #12528) 100 mLを精製水 900 mLに加え、混合してください。
  2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free #47746
  3. 100% Methanol #13604：使用前に 氷冷してください。
  4. 抗体希釈バッファー：すぐに使用可能なFlow Cytometry Antibody Dilution Buffer #13616 を購入するか、0.5 gのBovine Serum Albumin (BSA) (#9998) を100 mLの1X PBSに溶解して0.5% BSA PBSバッファーを調製してください。4°Cで保存してください。
  5. 推奨二次抗体​：未標識 抗体を検出する際は、使用する一次抗体の宿主種 (例：ラビット) に対応 した二次抗体を選択してください。 フローサイトメトリー検証済み二次抗体の最新製品リストはこちらをご覧ください。
  6. (オプション) FluoroClear Blocking Buffer #33449

注意：蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、各色素の製品ページ の推奨プロトコールを確認してください。 フローサイトメトリーでの使用が検証された、細胞染色色素の製品リストをご覧ください。

B. 固定

注意：接着細胞または組織は、固定の前に十分に解離させてシングルセル懸濁液にしてください。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。 一般的には、150-300 gで1-5分間の遠心分離で細胞を十分に沈殿させることができます。

注意：全血を用いる場合は、固定の前に赤血球を溶解し、 遠心分離して洗浄してください。

注意：ホルムアルデヒドまたはメタノールによってエピトープが損なわれる可能性がある場合は、CDマーカーまたは他の細胞外タンパク質を標的とする抗体を固定前に加えてください。この場合、抗体を 標的に結合させた状態で固定と透過化プロセスを行います。ただし、一部の 蛍光色素 (PEやAPC) はメタノールにより損傷を受けるため、透過化の前に 加えないでください。初めて 実験を行う際は、スモールスケールで予備実験を行うことを推奨します。

  1. 遠心分離で細胞を沈殿させて、上清を除去してください。
  2. 100万個の細胞につき、約100 µLの4%ホルムアルデヒドで細胞を再懸濁してください。細胞間でクロスリンクが生じないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25°C) で15分間固定してください。
  4. 透過化のステップに進んでください。
    1. あるいは、細胞を1X PBS中で一晩保存することもできます。過剰量の1X PBS中で遠心分離して洗浄し、 ホルムアルデヒドを除去してください。ホルムアルデヒドを含む 上清は適切な廃棄容器に捨ててください。 1X PBSで細胞を再懸濁し、4°Cで保存してください。

C. 透過化処理

  1. あらかじめ冷やしておいた 細胞に、氷冷した100%メタノールを穏やかにボルテックスしながら最終濃度が90%になるようにゆっくりと加えてください。 あるいは、上に記載したように、遠心分離してホルムアルデヒドまたはPBSを除去し、 氷冷した90%メタノール (v/v、1X PBS) で再懸濁してください。
  2. 氷上で10分間以上静置し、透過化してください。
  3. 免疫染色 (セクションD) に進むか、細胞を-20°Cで (90% メタノール中) で保存してください。

D. 免疫染色

注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。 一般的には、150-300 gで1-5分間の遠心分離で細胞を十分に 沈殿させることができます。抗体希釈バッファーで洗浄すると、PBSを用いた場合と比べて洗浄ステップでの細胞の 損失を低減できます。

  1. 必要な細胞数をチューブまたはウェルに分注してください。(通常、1アッセイにつき5x105 -1x106細胞が必要です。)
  2. 過剰量の1X PBS中で遠心分離して細胞を洗浄し、メタノールを除いてください。上清は 適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. オプション：非特異的バックグラウンドを低減するため、標識 抗体を添加する前に、細胞懸濁液にFluoroClear ブロッキングバッファーを5 µL加えてください。
  4. 細胞を、抗体希釈バッファーで推奨希釈率またはタイトレーションにより決定した希釈率 に調整した一次抗体希釈液100 µLに 再懸濁してください。
  5. 室温で1時間インキュベートしてください。
  6. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清 を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。直接標識抗体を用いる場合は、ステップ ​9に進んでください。
  7. 細胞を、100 µLの希釈した蛍光標識 二次抗体溶液 ( 推奨希釈率になるように抗体希釈バッファーで調整済み) で再懸濁してください。
  8. 室温で30分間インキュベートしてください。
  9. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清 を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。
  10. 細胞を1X PBS 200-500 µLで再懸濁し、フロー サイトメーターで解析してください。

ご質問がありましたら、いつでもお問い合わせください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

作成日：2025年9月