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フローサイトメトリー (Triton X-100透過化プロトコール)

重要： 製品ウェブページに記載の各製品専用フローサイトメトリープロトコールで、適切な固定および透過化の 条件、抗体の推奨希釈率を確認してください。

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995に含まれています。 下に記載されているカタログ番号から、個別にご購入いただくこともできます。

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または 同等の精製水で調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)：1X PBSを1 L調製する場合は、10X PBS ( #12528) 100 mLを精製水 900 mLに加え、混合してください。
  2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free #47746
  3. 細胞透過化バッファー：すぐに使用可能な製品 (#39487) を購入するか、10 mLを調製するには、30 µLのTriton™ X-100を 抗体希釈バッファー10 mLに加えてください。4°Cで保存してください。
  4. 抗体希釈バッファー：すぐに使用可能なFlow Cytometry Antibody Dilution Buffer #13616を購入するか、 0.5 gのBovine Serum Albumin (BSA) (#9998) を100 mLの1X PBSに溶解して0.5% BSA PBSバッファーを調製してください。 4°Cで保存してください。
  5. 推奨二次抗体​：未標識 抗体を検出する際は、使用する一次抗体の宿主種 (例：ラビット) に対応 した二次抗体を選択してください。 フローサイトメトリー検証済み二次抗体の最新製品リストはこちらをご覧ください。
  6. (オプション) FluoroClear Blocking Buffer #33449

注意：蛍光細胞染色色素 (生死判定色素、DNA色素など) を使用する場合は、各色素の製品ページ の推奨プロトコールを確認してください。 フローサイトメトリーでの使用が検証された、細胞染色色素の製品リストをご覧ください。

B. 固定と透過化

注意：接着細胞または組織は、固定の前に十分に解離させてシングルセル懸濁液にしてください。

注意：遠心分離の最適条件は、細胞タイプや試薬の容量によって異なります。 一般的には、150-300 gで1-5分間の遠心分離で細胞を十分に沈殿させることができます。

注意：全血を用いる場合は、固定の前に赤血球を溶解し、 遠心分離して洗浄してください。

注意： エピトープがホルムアルデヒド やTriton™ X-100によって損傷を受ける可能性がある場合は、固定前にCDマーカーまたは他の細胞外タンパク質を標的とする抗体を追加してください。この場合、抗体を 標的に結合させた状態で固定と透過化プロセスを行います。 初めて行う実験については、スモールスケールで予備実験を行うことをお勧めします。

  1. 遠心分離で細胞を沈殿させて、上清を除去してください。
  2. 100万個の細胞につき、約100 µLの4%ホルムアルデヒドで細胞を再懸濁してください。細胞間でクロスリンクが生じないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25°C) で15分間固定してください。
  4. 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗浄してください。上清は適切な 廃棄容器に捨ててください。
  5. 100万個の細胞につき、約100 µLの細胞透過化バッファーを加えて細胞を再懸濁してください。
  6. 室温で10分間インキュベートしてください。
  7. 染色操作に進むか、PBSに懸濁して4°Cで一晩保存してください。

C. 免疫染色

注意：細胞数を血球計算盤かその他の方法で計測してください。

  1. 必要な細胞数をチューブまたはウェルに分注してください。(通常、1アッセイにつき5x105 -1x106細胞が必要です。)
  2. 細胞を遠心分離し、上清を捨ててください。
  3. 細胞を、抗体希釈バッファーで推奨希釈率またはタイトレーションにより決定した希釈率 に調整した一次抗体希釈液100 µLに 再懸濁してください。
  4. 室温 (20-25°C) で1時間インキュベートしてください。
  5. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清 を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。直接標識抗体を用いる場合は、ステップ ​9に進んでください。
  6. 抗体希釈バッファーで 推奨希釈率に従って希釈した蛍光標識二次抗体100 µLで、 細胞を再懸濁してください。
  7. 室温 (20-25°C) で30分間インキュベートしてください。遮光 してください。
  8. 抗体希釈バッファーまたは1X PBSに懸濁した細胞を遠心分離して洗浄してください。上清 を捨ててください。もう一度、このステップを行ってください。
  9. 細胞を1XPBSで再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

ご質問がありましたら、いつでもお問い合わせください。

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

作成日：2025年9月