免疫組織化学染色プロトコール (凍結切片) - SignalStain^® Boost Detection Reagent

*重要：製品が凍結組織切片 (IHC-F) で検証され使用が承認されているかどうかについては、製品ウェブページで確認してください。適切な抗体希釈率および抗原賦活化溶液は、製品ウェブページをご覧ください。

注意：各製品の推奨条件は製品ウェブページをご覧ください。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. キシレン
2. エタノール (無水変性、病理学グレード 100%および95%)。
3. ヘマトキシリン (オプション)
4. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH₂O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
5. 固定液：最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。
   1. 10%中性緩衝ホルマリン
   2. アセトン
   3. メタノール
   4. 3%ホルムアルデヒド：100 mLを用意する場合は、1X PBS 81.25 mLに16%ホルムアルデヒド18.75 mLを加えてください。
6. 10X Tris Buffered Saline (TBS) 洗浄バッファー：(#12498) 1X TBS 1 Lを用意する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH₂O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
7. メタノール/ペルオキシダーゼ：30%過酸化水素水 (H₂O₂) 10 mLをメタノール90 mLに加えてください。-20℃で保存してください。
8. ブロッキング液：1X TBS/0.3% Triton™ X-100/5% Normal Goat Serum (#5425)。1X TBS 9.5 mLに正常ヤギ血清500 µLとTriton™ X-100 30 µLを加えてください。
9. 検出システム：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP標識マウス用 #8125、HRP標識ラビット用 #8114)
10. 基質：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)

B. 切片作製

1. 組織は-80℃で保存してください：切片を作製する前に冷凍庫から取り出し、-20℃で約15分間平衡化してください。これにより切片作製時のブロックの亀裂を防ぐことができます。
2. 6-8 µmの範囲で組織を薄切し、正に帯電したスライドに貼り付けてください。
3. 固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これにより切片のスライドへの接着が促進されます)。

C. 固定

注意：最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。

1. スライド上で切片が乾いたことを確認し、下記の手順で最適な固定液で固定してください。
   1. 10%中性緩衝ホルマリン：室温で10分間浸漬してください。すぐに染色操作Dへ進んでください。
   2. 冷アセトン：-20°Cで10分間浸漬してください。その後風乾してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
   3. メタノール：-20°Cで10分間浸漬してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
   4. 3%ホルムアルデヒド：室温で15分間浸漬してください。すぐに染色操作Dに進んでください。
   5. 3%ホルムアルデヒド/メタノール：3%ホルムアルデヒドに室温で15分間浸漬した後、メタノールに-20℃で5分間浸漬してください (途中ですすがないでください)。すぐに染色操作Dに進んでください。

D. 染色

1. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
2. メタノール/ペルオキシダーゼで、室温、10分間インキュベートしてください。
3. 洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗ってください。
4. ブロッキング液100-400 µLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
5. ブロッキング液を除去し、推奨希釈率で希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に添加してください。
6. 4℃で一晩インキュベートしてください。
7. SignalStain^® Boost Detection Reagentを室温に戻してください。
8. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗ってください
9. 切片を覆うようにSignalStain^® Boost Detection Reagentを滴下 (1-3滴) してください。加湿チャンバー内 (室温) で30分間インキュベートしてください。
10. 洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
11. 使用前にSignalStain^® DAB Chromogen Concentrate 1滴 (30 µL) をSignalStain^® DAB Diluent 1 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
12. 調製したSignalStain^® DAB溶液 100-400 µLを各切片に加え、注意深く観察してください。通常は1-10分間で十分な染色強度が得られます。
13. スライドを精製水 (dH₂O) に浸してください。
14. 必要に応じて、製造元の指示に従い、ヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
15. 精製水 (dH₂O) で切片を各5分間、2回洗浄してください。
16. 切片を脱水してください：
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
17. 切片をカバーガラスで封入してください。