ウェスタンブロッティングプロトコール

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS)：(#9808)、1X PBSを1 L調製する場合、20X PBS 50 mLをdH2O 950 mLに加え、混合してください。
2. 10X Tris Buffered Saline (TBS)：(#12498)、 1X TBSを1 L調製する場合、10X 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
3. 1X SDS Loading Buffer：(Blue Loading Pack #7722またはRed Loading Pack #7723) 3X SDS Loading Bufferに1/10量の30X DTTを加え、使用直前に 3X Reducing Loading Bufferを調製してください。dH2Oで1Xに 希釈してください。
4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer：(#4050) 1X Running Bufferを1 L調製する場合は、10X Running Buffer 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer：(#12539) 1X Transfer Bufferを 1 L調製する場合は、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mLとdH2O 700 mLに加え、混合してください。
6. 10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：(#9997)、1X TBSTを1 L調製する場合は、10X TBST 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
7. 脱脂粉乳：(#9999)
8. ブロッキングバッファー：5% (w/v) 脱脂粉乳含有1X TBSTを150 mL調製する場合、脱脂粉乳7.5 gを 1X TBST 150 mLに加え、よく撹拌してください。
9. 洗浄バッファー：(#9997) 1X TBST
10. ウシ血清アルブミン (BSA)：(#9998)
11. 一次抗体希釈バッファー：5% (w/v) のBSAまたは脱脂粉乳 (推奨されるバッファーについては、 一次抗体の製品ウェブページで確認してください) を含有する1X TBSTを20 mL調製する場合は、BSAまたは脱脂粉乳1.0 gを1X TBST 20 mLに加え、よく混合してください。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)
13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)
14. 転写膜とろ紙：(#12369) このプロトコールは、 ニトロセルロース膜用に最適化されています。一般的にポアサイズは0.2 µmを推奨します。
15. HRP標識二次抗体：anti-rabbit (#7074)、anti-mouse (#7076)
16. 検出試薬：LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide (#7003) あるいは SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

1. 調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
3. 1X SDS Sample Bufferを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、10 cm 径のプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。速やかにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を微量遠心分離用 チューブに移してください。氷上で保持してください。
4. 10-15秒間ソニケートし、細胞を完全に溶解してDNAを剪断してください (これにより、サンプルの粘性が下がります)。
5. サンプル20 µLを95-100°Cで5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
6. 5分間、遠心分離してください。
7. SDS-PAGEゲル (10 cm x 10 cm) に20 µLをロードし、電気泳動してください。
   注意：転写状態の確認用に プレステイン分子量マーカー (#59329、 5 µL/レーン) を、分子量の決定用にビオチン化プロテインラダー (#7727、 10 µL/レーン) をロードすることを推奨します。
8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：サイズは10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜に対するものです。 サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

1. ​オプション：転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗浄してください。
2. 転写膜をブロッキングバッファー25 mL中で緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。

II. 一次抗体反応

使用する一次抗体に応じて、下記の中から適切な手順を選択してください。

未標識一次抗体の場合

1. 一次抗体液10 mL ( 製品データシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を穏やかに振盪しながら、4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
3. 一次抗体の宿主種に応じたHRP標識二次抗体 (#7074または#7076、1:2000) とビオチン化タンパク質マーカー検出用の HRP標識ビオチン抗体 (#7075、 1:1000-1:3000) を10 mLのブロッキングバッファーで希釈し、その中で転写膜を穏やかに 振盪しながら1時間、室温でインキュベートしてください。
4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
5. 検出 (セクションD) のステップに進んでください。

HRP標識一次抗体の場合

1. 一次抗体を一次抗体希釈バッファー10 mLで希釈し (各製品データシートで適切な希釈率を確認してください)、その中で転写膜を穏やかに振盪しながら、4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
3. (オプション) ビオチン化タンパク質マーカーを検出する場合は、転写膜をAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、 1:1000-1:3000) を含む10 mLのブロッキングバッファー中で穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。
4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
5. 検出 (セクションD) のステップに進んでください。

ビオチン標識一次抗体の場合

1. 一次抗体を一次抗体希釈バッファー10 mLで希釈し (各製品データシートで適切な希釈率を確認してください)、その中で転写膜を穏やかに振盪しながら、4°Cで一晩インキュベートしてください。
2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
3. Streptavidin-HRP (#3999) をブロッキングバッファー10 mLで適切な希釈率で 希釈し、その中で転写膜を穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートしてください。 
   注意：Streptavidin-HRPで、ビオチン化タンパク質マーカーも検出できます。追加のAnti-biotin, HRP-linked Antibody を用いた インキュベーションは不要です。
4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
5. 検出 (セクションD) のステップに進んでください。

D. タンパク質の検出

1. 転写膜を、LumiGLO 10 mL (20X LumiGLO #7003　0.5 mL、20X peroxide 0.5 mLおよび精製水9.0 mL) あるいはSignalFire™ #6883 10 mL (Reagent A 5 mL、 Reagent B 5 mL) で穏やかに振盪しながら室温で1分間インキュベートしてください。
2. 転写膜上の余分な液を除去し (この時、乾燥させないようにご注意ください)、ラップで包んでX線 フィルムに露光してください。最初の 10秒間の露光結果から、適切な露光時間を予測してください。
   注意：検出反応の 速度論に基づき、シグナルはインキュベーション直後が最も強く、2時間 かけて 減衰します。