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ウェスタンブロッティングプロトコール (蛍光)

注意：TrueBlack® Fluorescent Western Blot Blocking Buffer Kit (#40683) には、転写膜のブロッキングと、一次抗体および二次抗体の希釈に必要なバッファーが含まれています。

注意：2色を同時検出するウェスタンブロッティングでは、宿主種の異なる一次抗体と、異なる色素で標識した適切な二次抗体が必要です。エピトープのオーバーラップは干渉を生じることがあり、2重蛍光ウェスタンブロットではこれを考慮する必要があります。一次抗体のインキュベーションバッファーが異なる場合は、一次抗体を両方のバッファーで別々に試験し、同時検出に最も適したバッファーを特定してください。

A. 溶液および試薬

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS)：(#9808) 1X PBSを1 L調製する場合、20X PBS 50 mLをdH2O 950 mLに加え、混合してください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS)：(#12498) 1X TBSを1 L調製する場合、10X TBS 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
  3. 1X SDS Loading Buffer：(Blue Loading Pack #7722またはRed Loading Pack #7723) 3X SDS Loading Bufferに1/10量の30X DTTを加えて、使用直前に3X Reducing Loading Bufferを調製してください。dH2Oで1Xに希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer：(#4050) 1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer：(#12539) 1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mLとdH2O 700 mLに加え、混合してください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X)：(#9997)、1X TBSTを1 L調製する場合、10X TBST 100 mLをdH2O 900 mLに加え、混合してください。
  7. 洗浄バッファー：1X TBST
  8. TrueBlack® WB Blocking Buffer ：(#57443) すぐに使用できる溶液です。
  9. TrueBlack® WB Antibody Diluent ：(#78710) すぐに使用できる溶液です。(二次抗体：anti-rabbit #5151と#5366、anti-mouse #5257と#5470)。
  10. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)
  11. 転写膜とろ紙：(#12369) ニトロセルロース膜の使用を推奨します。このプロトコールは、ニトロセルロース膜用に最適化されています。ポアサイズは0.2 µmを推奨します。

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養液から培地を吸引除去し、冷却した1X PBSで細胞を洗浄した後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDS Sample Bufferを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、10 cm径のプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。速やかにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を微量遠心分離用チューブに移してください。氷上で保持してください。
  4. 10-15秒間ソニケートし、細胞を完全に溶解してDNAを剪断してください (これにより、サンプルの粘性が下がります)。
  5. サンプル20 µLを95-100°Cで5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間、遠心分離してください。

  7. SDS-PAGEゲル (10 cm x 10 cm) に20 µLをロードし、電気泳動してください。

    注意：転写の確認や分子量の決定のために、プレステイン分子量マーカー (#59329、10 µL/レーン) もロードして電気泳動することを推奨します。プレステインマーカーには、近赤外波長の自家蛍光があります。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜を使う際は、適宜量を調節してください。

  1. ​オプション：転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗浄してください。

  2. 使用前にTrueBlack® WB Blocking Bufferを室温に戻し、よく混合してください。

    注意：TrueBlack® WB Blocking Bufferにわずかな沈殿物がみられる場合がありますが、性能に影響はありません。

  3. 転写膜を室温で45分間、TrueBlack® WB Blocking Buffer 10 mL中でインキュベートしてください。
  4. TrueBlack® WB Blocking Bufferを除去してください。
  5. 製品のデータシートに記載されている推奨希釈率に従って、一次抗体をTrueBlack® WB Antibody Diluentで適切に希釈して一次抗体反応液を調製し、転写膜を一次抗体反応液10 mL中で、穏やかに振盪しながら4°Cで一晩インキュベートしてください。
  6. TBST 15 mLで各10分間、5回洗浄してください。
  7. 蛍光標識二次抗体 (#5470、#5257、#5366、#5151) をTrueBlack® WB Antibody Diluent 10 mLに希釈 (1 mg/mLストックを1:5000-1:25,000希釈) して二次抗体反応液を調製し、遮光して転写膜を二次抗体反応液10 mL中で、穏やかに振盪しながら室温で2時間インキュベートしてください。
  8. 遮光しながらTBST 15 mLで各10分間、5回洗浄してください。

D. タンパク質の検出

  1. 余分なTBSTを除去し、転写膜を乾かしてください。

    重要なステップ：蛍光染色するには、転写膜を乾燥させる必要があります。

  2. 適切な蛍光スキャナーを使用して、メーカーの指示に従い転写膜をスキャンしてください。