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手動のSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色に用いるSignalStar™ Secondary Antibodyキットプロトコール

製品情報：

signalstar-8plex  

保存：キットのすべての構成品を-20°Cで保存してください。

安定性：キットのすべての構成品は、推奨された温度で保存した場合、少なくとも12 か月間安定性を維持します。5回を超える凍結/解凍サイクルは、行わないでください。

適用：SignalStarキットは、蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色を行う際にご使用いただけます。

スライド数：このキットには、10枚のスライドの染色に必要な材料が含まれています。
SignalStarの記号

目次

1 はじめに：SignalStar染色の方法論

SignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) は、抗体やオリゴヌクレオチド (オリゴ)、蛍光色素を用いて標的の細胞内での存在や局在、機能、バイオマーカーとの共発現パターンを調査するための技術です。SignalStar技術は、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。 

SignalStarシステムの能力の源は、SignalStarに用いる抗体のデザインに存在します。これらの抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織で用いるために厳密に検証されており、その後、部位特異的な標識と徹底した精製法を用いて各オリゴヌクレオチド (オリゴ) タグに結合させます。高度に特異的な、相補的オリゴのネットワークと蛍光色素を用いることにより、科学者は、存在量が低いものも含めて3-8種類の標的のシグナルを増幅できます。

SignalStar Multiplex IHCのワークフロー図

図 1： ご希望のプレックスサイズ (最大3-8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体のカクテルを、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加します。蛍光色素標識済みの相補的オリゴ (チャンネル：488、594、647、750) を用いて、オリゴ-蛍光色素のコンストラクトを構築して抗体に結合させることにより、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルが増幅できます。プレックスのサイズが4より大きい場合は、1ラウンド目のオリゴと蛍光色素分子を穏やかに除去し、2ラウンド目で、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体を可視化するための増幅を行います。この相補的なオリゴシステムと蛍光色素の除去プロセスにより、交差反応を示すことなく、同じ基質を用いて2ラウンド目の抗体シグナルを増幅できます。その後、お手持ちの、または無料のソフトウェアを用いて、コンピューター上で2つの画像を結合し、最大8種類の標的で構成される画像を作成することができます。

2 溶液および試薬

2.1 キットに含まれる構成品

SignalStar™ Secondary Antibody Kitに含まれる構成品
最大3種類のSignalStarオリゴ標識二次抗体 (以下を参照)
最大3種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)
最大3種類の二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Multiplex IHC Buffer Kitに含まれる構成品
最大7種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (以下を参照)
最大7種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)
SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Amplification Oligo Set A：
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Amplification Oligo Set B：
 488
 594
 647
 750
SignalStar™ Ligation Buffer
T4 DNA Ligase (5 U/µL)
ATP (100 mM)
10X dsDNase Buffer
dsDNase
 

キットには、ご注文時にお選びいただいたSignalStarオリゴ標識抗体 (A) およびSignalStar相補的オリゴ (B) が含まれており、これらはオリゴ-抗体ペア (C) として共に梱包されています。以下の例をご参照ください。

SignalStarオリゴヌクレオチド標識抗体

2.2 キットに含まれない必要な試薬

  • 重要：SignalStar secondary antibodyの検出に必要な一次抗体
  • 重要：SignalStain® Antibody Diluent #8112またはその他の推奨一次抗体希釈液
  • SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747
  • キシレン (脱パラフィン用)
  • エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  • Decloaking Chamber (自動抗原賦活化装置) (Biocare Medical社、#DC2012)
  • Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
  • DAPI #4083
  • ProLong Gold Antifade Reagent #9071
  • Nuclease-free Water #12931
  • 10%中性緩衝ホルマリン液
  • 低吸着ピペットチップ
  • スライド処理コンテナ
  • 撥水性バリアペン
  • カバースリップ
  • 帯電スライド
  • コントロール組織

3 開始前の重要な考慮事項

警告

実験の開始前に、溶液調製のステップおよびプロトコール全体をお読みください。
警告

同じチャンネルの相補的オリゴを組み合わせて使用しないでください。 1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。
 
警告

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。 同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。
警告

一部のSignalStarキットの構成品には粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。 SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
注意

SignalStarパネルデザインが‭2ラウンドのイメージングを必要とするか否かを確認してください。 このページの9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
注意

染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。 この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。
注意

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。 イメージングの際に、DAPIに加えて4蛍光チャンネルが必要になります。機器の設定については、各プロバイダーに確認してください。
 
蛍光チャンネル 励起波長 (nm) 放射波長 (nm) レーザー線 一般的なフィルターセット
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7
注意

単染色したスライドを上記のスペクトルでイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。 これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、スペクトルの分離が可能になります。
注意

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。 明るいDAPI染色は、より良い画像の結合に役立ちます。
注意

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。 SignalStarプロトコールは、指定された抗原除去と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。
注意

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。 マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。
注意

組織の調製および固定には様々な手法が用いられるため、1:50から1:200の間のどの希釈率で使用しても十分な量の抗体試薬を提供しています。タイトレーションが必要かどうかを判断するために、最初の試験では各抗体を1:100で使用することを推奨します。
注意

染色プロセスの間では、スライドを乾燥させないように、可能な限りインキュベーション溶液とdH2Oを吸引除去してください。 次のステップに進む前に、各ステップの最後にスライドから液体を振り落としてください。
注意

次のSignalStarキット構成品は、使用前に一晩4℃で解凍できます。

  • SignalStar™ Antibody Diluent A
  • SignalStar™ Antibody Diluent B
  • SignalStar™ Amplification Buffer A
  • SignalStar™ Amplification Buffer B
  • SignalStar™ Ligation Buffer

 

4 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製

警告

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液を調製する前に、SignalStarイメージングラウンド1：セクション5の全プロトコールをお読みください。

注意

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後使用中は氷上で保管します。

4.1 Primary Antibody Solution

注意

一次抗体の希釈液と一次抗体は、このキットには含まれていません。 推奨される希釈液のメーカーが推奨する希釈で、一次抗体を使用してください。最終的な容量が、下の表の記載内容に合致することを確認してください。
注意

一次抗体を購入する際は、ホルマリン固定パラフィン包理組織での使用が検証済みであることを確認してください。 IHC-P検証済み抗体の包括的なカタログはwww.cellsignal.comでご覧いただけます。
警告

1種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合： 異なる宿主種由来の一次抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。同じ宿主種由来の一次抗体は組み合わせないでください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
Primary Antibody Diluent (例：SignalStain® Antibody Diluent #8112)    
各一次抗体 (例：FoxP3 (D2W8ETM) Rabbit mAb #98377)    
総量 750 1,500

4.2 SignalStar Secondary Antibody Solution

警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を、低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
注意

1種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：各宿主種由来の一次抗体 (例：抗ラビット、抗マウス、抗ラット) を検出するための二次抗体および相補的オリゴをすべて混合して使用します。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
各二次抗体 - SignalStar標識抗体 7.5 15
各二次抗体 - 相補的オリゴ 7.5 15
総量 最大795 最大1,590

4.3 SignalStar Secondary Blocking Solution

警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を、低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
注意

1つ以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
各二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体 7.5 15
総量 最大772.5 最大1,545

4.4 Imaging Round 1 Solution

注意

調製後の溶液には、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大7種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページの9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
警告

同じチャンネルの相補的オリゴを組み合わせて使用しないでください。 1回目のイメージングラウンドおよび2回目のイメージングラウンドに用いる相補的オリゴを混合しないでください。
警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を、低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
各SignalStarオリゴ標識抗体 7.5 15
各イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo 7.5 15
総量 最大825 最大1,650

4.5 イメージングラウンド1：Amplification Solution 1

警告

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-750 60 120
総量 6,240 12,480

4.6 イメージングラウンド1：Amplification Solution 2

警告

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-750 60 120
総量 6,240 12,480

4.7 イメージングラウンド1：Ligation Solution

注意

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上に保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA Ligase (5 U/µL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
総量 750 1,500

4.8 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

  • 1X EDTA Unmasking Solution：250 mLの1X EDTA Unmasking Solutionを調製する場合は、25 mLのSignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) #14747を225 mLのdH2Oで希釈してください。
  • 10%中性緩衝ホルマリン液
  • 1X Tris Buffered Saline with Tween‭20 ‬(TBST)：1 Lの1X TBST を調製する場合は、100 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を、900 mLのdH2Oに加え、攪拌してください。

5 SignalStarイメージングラウンド1：プロトコール

警告

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液を調製する前に、SignalStarイメージングラウンド1：セクション5の全プロトコールをお読みください。

5.1 スライドベーキング

注意

実験開始の前日にスライドベーキングを行うことができます。 このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
 

1. スライドを、60°Cで30分間以上インキュベートしてください。

5.2 脱パラフィン/水和

注意

スライドの脱パラフィン後は、どの時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。すべてのインキュベーションステップで、加湿チャンバーを使用してください。各溶液で組織の全体を確実にカバーしてください。
 

2. 切片をキシレン洗浄液に浸し、5分間インキュベートしてください。3回繰り返します。
 

3. 切片を100%エタノール洗浄液に浸し、10分間インキュベートしてください。2回繰り返します。
 

4. 切片を95%エタノール洗浄液に浸し、10分間インキュベートしてください。2回繰り返します。
 

5. 切片をdH2Oに浸し、5分間洗浄してください。2回繰り返します。

5.3 抗原賦活化

注意

エピトープを最大限に賦活化するために、自動抗原賦活化装置 (圧力釜) を用いたEDTAによる抗原賦活化を推奨します。このプロトコールでは、Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の推奨条件を記載しています。各デバイス専用の設定：他の自動抗原賦活化装置 (圧力釜) を使用する場合は、メーカー推奨の操作方法を確認してください。
 
6. 
 		 室温で250 mLの1X EDTA Unmasking Solutionが入った24スライド用ホルダーに、スライドを設置してください。スライドホルダーがすべて埋まるように、ブランクのスライドを加えてください。
 

7. 500 mLのdH2Oを自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れてください。
 

8. スライドホルダーをヒートシールドの上に乗るよう自動抗原賦活化装置 (圧力釜) 内に置いてください。スライドコンテナ用の蓋で、部分的にカバーしてください。
注意

ブランクのスライドと、250 mLの水​が入った24枚用スライドホルダーも自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れることを推奨します。
 

9. 蓋を閉めて、賦活化を進めてください。Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の設定は、110°Cで30分です。
 

10. 慎重に装置の排気を行い、その後、蓋を外してください。
 

11. 自動抗原賦活化装置 (圧力釜) からスライド容器を取り出し、実験台上で10分間冷却してください。
 
12. 
 		 スライドのコンテナをdH2Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH2Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。

5.4 一次抗体および二次抗体を用いた染色

 

13. スライドから液体を完全に振り落とし、メーカーのプロトコールに従って希釈した150 µLを加えて一次抗体でインキュベートしてください。
注意

プロトコールを複数の日に分けて行う場合は、スライドをPrimary Antibody Solutionに浸し、4°Cで一晩インキュベートしてください。

 

14. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。
 

15. スライドから液体を完全に振り落とし、150 µLのSecondary Antibody Solutionに浸して、室温で40分間インキュベートしてください。
 

16. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。
 

17. スライドから液体を完全に振り落とし、150 µLのSecondary Blocking Solutionに浸して、室温で40分間インキュベートしてください。
 

18. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。
 

19. スライドを10%中性緩衝ホルマリン液に浸し、室温で5分間インキュベートしてください。
 

20. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

5.5 イメージングラウンド1：染色

 

21. スライドを150 µLのSignalStar Imaging Round 1 Solutionに浸し、室温で40分間インキュベートしてください。
注意

プロトコールを複数の日に分けて行う場合は、スライドを4°Cで一晩インキュベートしてください。

 

22. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。
 

23. スライドを10%中性緩衝ホルマリン液に浸し、室温で5分間インキュベートしてください。
 

24. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

5.6 イメージングラウンド1：増幅

 
25. 
 		 Amplification Solutions 1および2を用いて、8ラウンドの増幅を行ってください。セクション8.2に記載しているSignalStarイメージングラウンド1チェックリストを用いて進捗を追跡してください。各増幅ラウンドでは、以下のステップを行ってください：
  1. スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
  2. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。
  3. スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
  4. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

5.7 イメージングラウンド1：ライゲーション

 

26. スライドを150 µLのSignalStar Ligation Bufferに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。
 

27. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

5.8 イメージングラウンド1：イメージング

 

28. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
 

29. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
 

30. DAPI溶液で対比染色してください。
 

31. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
 

32. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
 

33. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最大8時間は強いシグナルが得られます。
注意

イメージング完了後すぐに、次のラウンドのイメージングが行えるように、蛍光シグナルをスライドから取り除くことができます。イメージングの1ラウンド目に続いて、可能な限り速やかに2ラウンド目を行ってください。

6 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製

警告

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。

注意

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施します。このページの9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
注意

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後使用中は氷上で保管します。

6.1 Fluorescence Removal Solution

注意

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上に保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
10X dsDNase Buffer 75 150
dsDNase 7.5 15
Nuclease-free Water #12931 667.5 1,335
総量 750 1,500

6.2 Imaging Round 2 Solution

注意

混合したSignalStarイメージングラウンド2溶液には、イメージングラウンド2用の相補的オリゴヌクレオチドのみが含まれていなければなりません。このページの9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。
警告

イメージングラウンド2溶液に、Signal Star標識抗体を加えないでください。
警告

同じチャンネルの相補的オリゴを組み合わせて使用しないでください。 1回目のイメージングラウンドおよび2回目のイメージングラウンドに用いる相補的オリゴを混合しないでください。
警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A 525 1,050
SignalStar Antibody Diluent B 225 450
各イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo 7.5 15
総量 最大780 最大1,560

6.3 イメージングラウンド2：Amplification Solution 1

警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo A-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo A-750 60 120
総量 6,240 12,480

6.4 イメージングラウンド2：Amplification Solution 2

警告

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。 使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A 3,000 6,000
SignalStar Amplification Buffer B 3,000 6,000
SignalStar Amplification Oligo B-488 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-594 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-647 60 120
SignalStar Amplification Oligo B-750 60 120
総量 6,240 12,480

6.5 イメージングラウンド2：SignalStar Ligation Solution

注意

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上に保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。
 

キット構成品/試薬		 必要な容量
5スライド (µL) 10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer 375 750
Nuclease-free Water #12931 352.5 705
T4 DNA Ligase (5 U/µL) 15 30
ATP (100 mM) 7.5 15
総量 750 1,500

7 SignalStarイメージングラウンド2：プロトコール

警告

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。

注意

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施します。このページの9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

7.1 蛍光シグナルの除去

 

1. イメージングラウンド1のイメージング完了後に、組織を損傷することなく穏やかにカバースリップを取り外すために、スライドをdH2O中に30分間以上浸してください。
 

2. 150 µLのFluorescent Removal Solutionに37°Cで2時間スライドをインキュベートしてください。
 

3. スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
 

4. オプション：

  1. ProLong Gold Antifade Reagent #9071 (DAPI #4083を含む) でスライドを封入し、蛍光シグナルが残っていないことを確認するためにスライドのイメージングを行ってください。
  2. dH2O中にスライドを30分間以上浸し、組織を傷つけないようにカバースリップを穏やかに外してください。
  3. スライドをdH2Oに30秒間浸してください。

7.2 イメージングラウンド2：染色

 

5. 150 µLのSignalStarイメージングラウンド2溶液に室温で40 分間スライドをインキュベートしてください。
 

6. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

7.3 イメージングラウンド2：増幅

 
7. 
 		 Amplification Solutions 1および2を用いて、8ラウンドの増幅を行ってください。セクション8.3中のSignalStarイメージングラウンド2チェックリストを使って進捗を追跡してください。 各増幅ラウンドでは、以下のステップを行ってください：
  1. スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
  2. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。
  3. スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
  4. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

7.4 イメージングラウンド2：ライゲーション

 

8. スライドを150 µLのSignalStar Ligation Bufferに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。
 

9. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。

7.5 イメージングラウンド2：イメージング

 

10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
 

11. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
 

12. DAPI溶液で対比染色してください。
 

13. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。
 

14. スライドから液体を完全に振り落とし、dH2Oに30秒間浸してください。
 

15. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
 

16. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最大8時間は強いシグナルが得られます。

8 ユーザーワークシート

8.1 SignalStarパネルデザインワークシート

オリゴ標識抗体 相補的オリゴ 製品ペア＃ イメージングラウンド 488 594 647 750
               
               
               
               
               
               
               
               

(付録9.1でパネルデザインの例をご覧ください。)

8.2 SignalStarイメージングラウンド1チェックリスト

増幅ラウンド ステップ# ✓ 手順
増幅ラウンド1 1 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
2 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
3 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
4 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド2 5 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
6 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
7 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
8 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド3 9 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
10 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
11 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
12 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド4 13 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
14 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
15 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
16 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド5 17 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
18 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
19 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
20 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド6 21 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
22 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
23 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
24 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド7 25 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
26 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
27 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
28 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド8 29 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
30 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
31 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
32 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。

8.3 SignalStarイメージングラウンド2チェックリスト

増幅ラウンド ステップ# ✓ 手順
増幅ラウンド1 1 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
2 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
3 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
4 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド2 5 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
6 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
7 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
8 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド3 9 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
10 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
11 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
12 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド4 13 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
14 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
15 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
16 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド5 17 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
18 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
19 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
20 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド6 21 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
22 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
23 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
24 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド7 25 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
26 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
27 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
28 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
増幅ラウンド8 29 ☐ Amplification Solution 1中で8分間インキュベートしてください。
30 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。
31 ☐ Amplification Solution 2中で8分間インキュベートしてください。
32 ☐ スライドをdH2Oに30秒間浸してください。

9 付録

9.1 SignalStarパネルデザインの例

オリゴ標識抗体 相補的オリゴ 製品ペア＃ イメージングラウンド 488 594 647 750
Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Antibody 相補的オリゴ
(CO-0055-488)		 30599 1 ●      
PD-L1 (E1L3N®) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0005)		 相補的オリゴ
(CO-0005-594)		 28249 1   ●    
TIM-3 (D5D5R™) XP®Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0010)		 相補的オリゴ
(CO-0010-647)		 15231 1     ●  
Ki-67 (8D5) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0014)		 相補的オリゴ
(CO-0014-750)		 56398 1       ●
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0004)		 相補的オリゴ
(CO-0004-488)		 45747 2 ●      
CD68 (D4B9C) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0007)		 相補的オリゴ
(CO-0007-594)		 77318 2   ●    
CD20 (E7B7T) XP® Rabbit mAb
(SignalStar™ Conjugate 0011)		 相補的オリゴ
(CO-0011-647)		 36775 2     ●  
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb
(SignalStar™ Conjugate 0003)		 相補的オリゴ
(CO-0003-750)		 97227 2       ●

9.2 トラブルシューティングとよくある質問

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーでお選びいただける各抗体を入念に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、従来の発色アッセイでも用いられるこれらの抗体は、この蛍光アッセイの基礎となるため、厳密に試験されています。すべてのマルチプレックス構成や組織をテストすることはできません。ご質問がありましたら、カスタマーサポートまでお問い合わせください。

SignalStarキットと試薬を、使用を予定している組織で最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。標的の特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどと調整することにより、実験で最適なシグナルを取得できます。バックグラウンドレベルを低く抑え、高いS/Nレベルを得るために、このように狭い範囲でのタイトレーションが必要な場合があります。

SignalStar Multiplex IHCの画像取得に必要なイメージング装置の仕様は何ですか？

DAPIに加えて、4種類の蛍光チャンネルが必要です。装置の仕様については、プロバイダーにお問い合わせください。594チャンネルの可視化にTexas Redフィルターセットが使用されていることを確認してください。TRITCフィルターは、最適ではないためシグナル出力が低下する場合があります。

蛍光チャンネル 励起波長 (nm) 放射波長 (nm) レーザー線 一般的なフィルターセット
488 488 520 488 FITC
594 590 618 561/594 Texas Red
647 650 668 594/633 Cy®5
750 752 776 633 Cy®7

SignalStar mIHCは、シグナル増幅をベースとする技術であるため、初回のイメージングには、自動露光コントロール組織を用いて各チャンネルの最適な露光時間を特定することを推奨します。

一部のイメージング装置では、594と647チャンネルの間でスペクトルの漏れ込みが発生する場合があります。647チャンネルに添加する抗体の濃度を減らすことにより、シグナルの漏れ込みを解決できる可能性があります。シグナルが強い表現型マーカーと、発現レベルがより低い標的をスペクトル分離できるように、パネルを設計する際にもスペクトルの漏れ込みを考慮してください。

このアッセイは凍結した組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、凍結された組織での使用はまだ検証されていません。

使用可能な抗マウス抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで「Mouse」を選択すると、抗マウス抗体のリストが表示されます。

利用可能な抗体のリストに目的の標的が見当たりません。他の抗体をパネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬は、メニューに含まれない抗体との使用に対してはまだ検証されていません。現在、SignalStar Multiplex IHCアッセイで、お手持ちの抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

SignalStar mIHCは、サンプルを破壊しない技術です。したがって、SignalStarアッセイ後に同じ組織で、目的の抗体を使用した直接免疫蛍光染色を行うことができます。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去し、直接、免疫蛍光染色で可視化できます。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬は、直接標識済み抗体と組み合わせての使用に対してはまだ検証されていません。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、SignalStar mIHCの直後に直接免疫蛍光染色を染色して可視化することができます。この方法で、強力な細胞表面マーカーに対する多くの直接標識抗体が機能することが分かっています。詳細は、この春のAACRで発表された最近のポスターをご覧ください。さらに、直接免疫蛍光染色イメージングに使用可能な、弊社の直接標識抗体の製品ラインをご覧ください。

連続切片のSignalStar染色を発色染色と比較すると、より多くの陽性細胞が見えます。この過剰な染色が正しいどうかを、どのように確認すれば良いですか？

最適化の過程で、蛍光染色は発色染色よりも高い陽性率を示す可能性があることが分かりました。過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色と共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8陽性細胞がCD3陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

1回目のイメージングラウンドは、染色完了後、最大8時間後までのイメージングにおいて強いシグナルを示すと考えられます。2回目のイメージングラウンドでは、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最大8時間後まではシグナルは強いと考えられます。

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、使用を予定している組織に対して最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。標的の特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどと調整することにより、実験で最適なシグナルを取得できます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？

各標的について、発色IHCで陽性であることことが示されたあらゆる組織が、ポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを用いてください。

このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？

最適な結果を得るためには、SignalStarのプロトコールから逸脱することはお勧めできません。しかし、プロトコールに詳述されている抗原賦活化方法を使えない場合は、蛍光シグナルが減少しますが、電子レンジを使用してみても良いかもしれません。存在量が低い標的を検出する場合は、電子レンジの使用はお勧めできません。この方法では結果の保証はできません。

電子レンジを使用した抗原賦活化をおこなうには：

1X EDTA賦活化溶液 mLを用意する：250 mLの1X EDTA Unmasking Solutionを調製する場合は、25 mLのSignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) を225 mLのdH2Oで希釈してください。スライドを1X EDTA賦活化溶液の入った容器に浸し、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します (出力レベル10で約2.5分間)。煮沸直前の温度 (95 - 98°C) で15分間加熱します。ほとんどの一般的な電子レンジでは、これはパワーレベル3で8分間、パワーレベル2で7分間ということになります。その後電子レンジから取り出し、スライドのコンテナをdH2Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH2Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。その後の冷却は必要ありません。

脂肪組織や厚い脳組織切片、または正常な腎臓組織などの自家蛍光が高い組織でこのアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

私たちは最適化の過程で多種多様な腫瘍や組織タイプを活用していますが、すべての組織や発現レベルを考慮できるわけではありません。推奨プロトコールに従えば、このアッセイはFFPE組織 (厚さ4 - 5uM) でも機能するはずです。また、このアッセイでは、高い増幅機能により強力かつ特異的なシグナルが得られるため、自家蛍光が非常に高いレベルの組織であっても解析できる可能性があります。

ProLong Gold Antifade Reagent #9071の代わりに、別の封入剤を使用することはできますか？

このプロトコールには、Prolong Antifade封入剤が最適です。社内試験により、SlowFade Antifade Reagentはシグナル強度に悪影響があることが分かっています。

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