手動のSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色に用いるSignalStar™ Secondary Antibody Kit

実験の開始前に、溶液調製のステップおよびプロトコール全体をお読みください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。

一部のSignalStarキットの構成品には粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStarパネルデザインで、2ラウンドのイメージングが必要か否かを確認してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。イメージングの際に、DAPIに加えて4種類の蛍光チャンネルを取得する必要があります。機器の提供元に連絡し、機器の設定を確認してください。

単染色したスライドを上記のスペクトルでイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、チャネルの分離が可能になる可能性があります。

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。明るいDAPI染色は、より正確な画像の位置合わせを可能にします。

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。SignalStarプロトコールは、指定された抗原賦活化と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。

組織の調製および固定には様々な手法が用いられるため、1:50から1:200の間のどの希釈率で使用しても十分な量の抗体試薬を提供しています。タイトレーションが必要かどうかを判断するために、最初の試験では各抗体を1:100で使用することを推奨します。

染色プロセスの間では、スライドを乾燥させない程度に、可能な限りインキュベーション溶液とdH₂Oを吸引除去してください。次のステップに進む前に、各ステップの最後にスライドから液体を振り落としてください。

次のSignalStarキット構成品は、使用前に一晩4℃で解凍できます。

• SignalStar™ Antibody Diluent A
• SignalStar™ Antibody Diluent B
• SignalStar™ Amplification Buffer A
• SignalStar™ Amplification Buffer B
• SignalStar™ Ligation Buffer

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

一次抗体の希釈液と一次抗体は、このキットには含まれていません。一次抗体は、推奨される希釈液を用いてメーカーが推奨する希釈倍率に調整してから使用してください。最終的な容量が、下の表の記載内容に合致することを確認してください。

一次抗体を購入する際は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織での使用が検証済みであることを確認してください。IHC-P検証済み抗体の包括的なカタログはwww.cellsignal.jpでご覧いただけます。

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の一次抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。同じ宿主種由来の一次抗体は組み合わせないでください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種を検出するための二次抗体および相補的オリゴをすべて混合して使用してください (例：抗ラビット、抗マウス、抗ラット)。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。

調製後のSignalStar Imaging Round 1 Solutionには、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大7種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。イメージングラウンド1およびイメージングラウンド2に用いる相補的オリゴを混合しないでください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。

スライドベーキングは、実験開始の前日に行うことができます。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。

1. スライドを、60°Cで30分間以上インキュベートしてください。

スライドの脱パラフィン後は、どの時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。すべてのインキュベーションステップで、加湿チャンバーを使用してください。各溶液で組織の全体を確実にカバーしてください。

2. 切片をキシレン洗浄液に浸し、5分間インキュベートしてください。3回繰り返してください。

3. 切片を100%エタノール洗浄液に浸し、10分間インキュベートしてください。2回繰り返してください。

4. 切片を95%エタノール洗浄液に浸し、10分間インキュベートしてください。2回繰り返してください。

5. 切片をdH₂Oに浸し、5分間洗浄してください。2回繰り返してください。

エピトープを最大限に賦活化するために、自動抗原賦活化装置 (圧力釜) を用いたEDTAによる抗原賦活化を推奨します。このプロトコールでは、Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の推奨条件を記載しています。各デバイス専用の設定：他の自動抗原賦活化装置 (圧力釜) を使用する場合は、メーカー推奨の操作方法を確認してください。

7. 500 mLのdH₂Oを自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れてください。

8. スライドホルダーをヒートシールドの上に乗るよう自動抗原賦活化装置 (圧力釜) 内に置いてください。スライドコンテナ用の蓋で、部分的にカバーしてください。

ブランクのスライドと、250 mLの水が入った2つ目の24枚用スライドホルダーも自動抗原賦活化装置 (圧力釜) に入れ、蓋で部分的にカバーすると有利な場合があります。

9. 蓋を閉めて、賦活化を進めてください。Biocare Medical社のDecloaking Chamber (#DC2012) 用の設定は、110°Cで30分間です。

10. 慎重に装置の排気を行い、その後、蓋を外してください。

11. 自動抗原賦活化装置 (圧力釜) からスライド容器を取り出し、実験台上で10分間冷却してください。

13. スライドから液体を完全に振り落とし、メーカーのプロトコールに従って希釈した150 µLのPrimary Antibody Solution中でインキュベートしてください。'

プロトコールを複数の日に分けて行う場合は、スライドをPrimary Antibody Solutionに浸し、4°Cで一晩インキュベートしてください。

14. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。

15. スライドから液体を完全に振り落とし、Secondary Antibody Solution 150 µLを加えて、室温で40分間インキュベートしてください。

16. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。

17. スライドから液体を完全に振り落とし、Secondary Blocking Solution 150 µLを加えて、室温で40分間インキュベートしてください。

18. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。

19. スライドを10%中性緩衝ホルマリン液に浸し、室温で5分間インキュベートしてください。

20. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

21. スライドを150 µLのSignalStar Imaging Round 1 Solutionに浸し、室温で40分間インキュベートしてください。

プロトコールを複数の日に分けて行う場合は、スライドを4°Cで一晩インキュベートしてください。

22. スライドから液体を完全に振り落とし、1X TBST中に30秒間浸してください。

23. スライドを10%中性緩衝ホルマリン液に浸し、室温で5分間インキュベートしてください。

24. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

1. スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
2. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。
3. スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
4. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

26. スライドを150 µLのSignalStar Ligation Bufferに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。

27. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

28. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。

29. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。

30. DAPI溶液で対比染色してください。

31. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。

32. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。

33. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最長8時間は強いシグナルが得られます。

イメージング完了後すぐに、次のラウンドのイメージングが行えるように蛍光シグナルをスライドから取り除くことができます。イメージングラウンド2は、イメージングラウンド1に続いて可能な限り速やかに行ってください。

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

混合したSignalStar Imaging Round 2 Solutionには、イメージングラウンド2用の相補的オリゴヌクレオチドのみが含まれていなければなりません。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

Imaging Round 2 Solutionに、SignalStar標識抗体を加えないでください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。イメージングラウンド1およびイメージングラウンド2に用いる相補的オリゴを混合しないでください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、SignalStarイメージングラウンド2：セクション7の全プロトコールをお読みください。

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。このページのセクション9.1および8.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

1. イメージングラウンド1のイメージング完了後に、組織を損傷することなく穏やかにカバースリップを取り外すために、スライドをdH₂O中に≥30分間浸してください。

2. スライドを150 µLのFluorescence Removal Solutionに浸し、37°Cで2時間インキュベートしてください。

3. スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。

4. オプション：

1. ProLong Gold Antifade Reagent #9071 (DAPI #4083を含む) でスライドを封入してスライドのイメージングを行い、蛍光シグナルが残っていないことを確認してください。
2. dH₂O中にスライドを≥30分間浸し、組織を傷つけないようにカバースリップを穏やかに外してください。
3. スライドをdH₂Oに30秒間浸してください。

5. スライドを150 µLのSignalStar Imaging Round 2 Solutionに浸し、室温で40分間インキュベートしてください。

6. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

1. スライドを150 µLのAmplification Solution 1に浸し、8分間インキュベートしてください。
2. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。
3. スライドを150 µLのAmplification Solution 2に浸し、8分間インキュベートしてください。
4. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

8. スライドを150 µLのSignalStarライゲーションバッファーに浸し、室温で20分間インキュベートしてください。

9. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。

11. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。

12. DAPI溶液で対比染色してください。

13. スライドを1X TBST中に30秒間浸してください。

14. スライドから液体を完全に振り落とし、dH₂Oに30秒間浸してください。

15. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。

16. 可能な限り速やかにスライドのイメージングを行ってください。最長8時間は強いシグナルが得られます。