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Leica Biosystems社のBOND RX全自動免疫染色装置で行うSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色に使用するSignalStar™ Secondary Antibody Kit

Leica Biosystems社のBOND RX全自動免疫染色装置で行うSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色に使用するSignalStar™ Secondary Antibody Kit

製品情報：

保存：キットのすべての構成品を-20°Cで保存してください。

安定性：キットのすべての構成品は、推奨された温度で保存した場合、少なくとも12か月間安定性を維持します。5回を超える凍結/解凍サイクルは、行わないでください。

適用：SignalStarキットは、蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色を行う際にご使用いただけます。

スライド数：このキットには、10枚のスライドの染色に必要な材料が含まれています。

1 はじめに：SignalStar™染色の方法論
2 溶液および試薬
3 開始前の重要な考慮事項
4 BOND RX全自動免疫染色装置の設定
5 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製
6 SignalStarイメージングラウンド1：BOND RXプロトコール
- 6.1 スライドベーキング
- 6.2 BOND RXプロトコールの実行
7 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製
8 SignalStarイメージングラウンド2：BOND RXプロトコール
- 8.1 カバーガラスの除去
- 8.2 BOND RXプロトコールの実行
9 ユーザーワークシート
10 Appendix
- 10.1 SignalStarパネルデザインの例
- 10.2 トラブルシューティングとよくある質問

1 はじめに：SignalStar™染色の方法論

SignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) は、抗体、オリゴヌクレオチド (オリゴ)、蛍光色素を用いて標的の細胞内での存在や局在、機能、バイオマーカーとの共発現パターンを調査するための技術です。SignalStar技術は、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。

SignalStarシステムの能力の源は、SignalStarに用いる抗体のデザインに存在します。これらの抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織で用いるために厳密に検証されており、その後、部位特異的な標識と徹底した精製法を用いて各オリゴヌクレオチド (オリゴ) タグに結合させます。高度に特異的な、相補的オリゴのネットワークと蛍光色素を用いることにより、科学者は、存在量が低いものも含めて3-8種類の標的のシグナルを増幅できます。

SignalStar Multiplex IHC WorkFlow Diagram

図1. ご希望のプレックスサイズ (最大3-8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体のカクテルを、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加してください。蛍光色素標識済みの相補的オリゴ (チャンネル：488、594、647、750) を用いて、オリゴ-蛍光色素のコンストラクトを構築して抗体に結合させることにより、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルが増幅できます。プレックスのサイズが4より大きい場合は、1ラウンド目のオリゴと蛍光色素を穏やかに除去し、2ラウンド目で、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体を可視化するための増幅を行います。この相補的なオリゴシステムと蛍光色素の除去プロセスにより、交差反応を示すことなく、同じ基質を用いて2ラウンド目の抗体シグナルを増幅できます。その後、2つの画像を、専用またはオープンソースのソフトウェアを用いてコンピューター上で位置合わせして結合し、最大8種類の標的を含む画像を作成します。

2 溶液および試薬

2.1 キットに含まれる構成品

SignalStar™ Secondary Antibody Kitに含まれる構成品

最大3種類のSignalStarオリゴ標識二次抗体 (以下を参照)

最大3種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)

二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Multiplex IHC Buffer Kitに含まれる構成品

最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (以下を参照)

最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Amplification Buffer A

SignalStar™ Amplification Buffer B

SignalStar™ Amplification Oligo Set A：

488

594

647

750

SignalStar™ Amplification Oligo Set B：

488

594

647

750

SignalStar™ Ligation Buffer

T4 DNA Ligase (5 U/µL)

ATP (100 mM)

10X dsDNase Buffer

dsDNase

キットには、ご注文時にお選びいただいた最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (A) および最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (B) が含まれており、これらはオリゴ-抗体ペア (C) として共に梱包されています。以下の例を参照してください。

SignalStar Oligo Antibodies

2.2 キットに含まれない必要な試薬

重要：SignalStar二次抗体による検出に必要な一次抗体
重要：SignalStain® Antibody Diluent #8112またはその他の推奨一次抗体希釈液
Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
DAPI #4083
ProLong Gold Antifade Reagent #9071
Nuclease-free Water #12931
10%中性緩衝ホルマリン液
低吸着ピペットチップ

2.3 キットに含まれない必要な試薬 (Leica Biosystems社から入手可能)

BOND Research Detection System #DS9455
BOND Aspirating Probe Cleaning Kit #CS9100
BOND Titration Kit (10 containers, 50 inserts) #OPT9049
BOND Open Containers 30 mL (10 pack) #OP309700
BOND Open Containers 7 mL (10 pack) #OP79193
BOND Universal Covertiles (160 pack) #S21.4611
BOND TM Epitope Retrieval 2-1 L (RTU) #AR9640
BOND Dewax Solution 1 L (RTU) #AR9222
BOND Wash Solution 10X Concentrate, 1L #AR9590

3 開始前の重要な考慮事項

実験の開始前に、溶液調製のステップおよびプロトコール全体をお読みください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。

一部のSignalStarキットの構成品には粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。コンテナやプロトコール、新しいBOND Research Detection Systemを作成してください。このプロトコールの実行には、BOND Research Detection Systemが必要です。

SignalStarアッセイの各ラウンドが完了したら、毎回BOND RXの吸引プローブの洗浄を行ってください。

SignalStarパネルデザインで、2ラウンドのイメージングが必要か否かを確認してください。このページのセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。イメージングの際に、DAPIに加えて4種類の蛍光チャンネルを取得する必要があります。機器の提供元に連絡し、機器の設定を確認してください。

蛍光チャンネル	励起波長 (nm)	蛍光波長 (nm)	レーザー線	一般的なフィルターセット
488	488	520	488	FITC
594	590	618	561/594	Texas Red
647	650	668	594/633	Cy^®5
750	752	776	633	Cy^®7

染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。

単染色した各スライドを、同じ蛍光チャンネルを用いてイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、スペクトルの分離が可能になります。

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。明るいDAPI染色は、より正確な画像の位置合わせを可能にします。

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。SignalStarプロトコールは、指定された抗原賦活化と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。

各抗体を1:100で使用することを推奨します。ただし、1:50または1:200のどちらの希釈率で使用した場合でも十分な量の抗体試薬を提供しています。

次のSignalStarキット構成品は、使用前に一晩4℃で解凍できます。

SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Ligation Buffer

4 BOND RX自動染色装置の設定

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。BOND RXソフトウェアバージョン7.0以上が必要です。

4.1 BOND RX全自動免疫染色装置上での新たな試薬の調製

以下の試薬は、SignalStarアッセイ用にBOND RXソフトウェア上で作成する必要があります。

BONDタイトレーションコンテナ

	1. Primary Antibody Solution
	2. Secondary Antibody Solution
	3. Secondary Blocking Solution
	4. MARKER (= SignalStar Staining Solution)
	5. Amplification Solution 1
	6. Amplification Solution 2
	7. Ligation Solution
	8. Fluorescence Removal Solution

BOND 7 mLオープンコンテナ

	9. 10%中性緩衝ホルマリン液
	10%中性緩衝ホルマリン液を作成する際は、"Hazardous"を選択し、廃液が適切に廃棄されることを確認してください。

BOND 30 mLオープンコンテナ

	10. 0.1X TBST
	11. 1X TBST (BOND Research Detection Systemへの連結に必要です)

4.2 BOND Research Detection Systemの設定

	1. 「CST SignalStar」と名付けた新しいBOND Research Detection Systemを作成してください。
	2. 1X TBSTを含む30 mLオープンコンテナを、CST SignalStar BOND Research Detection Systemに連結してください。
	ステップ2のオープンコンテナには具体的な名称をつけてください (例えば「0.1X TBST」ではなく「1X TBST」)。

4.3 SignalStarイメージングラウンド1およびイメージングラウンド2用のBOND RXプロトコールの作成

1. BOND RXソフトウェアで、「Protocol Setup」タブを選択してください。

2. 「*IF Protocol」を選択してください。(「Modified by」カラムにLeicaが表示されていることを確認してください。)

3. プロトコールのコピーを作成し、名称を「CST SignalStar Secondary Imaging Round 1」としてください。省略名の「CST Sec Rd1」を追加してください。

4. 「Show wash steps」を選択してください。

5.	すべてのステップを削除し、セクション9.2「BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1」に記載されているステップを追加してください。

6. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。

7. 「Create Protocol」を選択してください。

8. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。

9. 「CST SignalStar Secondary Imaging Round 1」プロトコールのコピーを作成してください。

10. コピーのファイル名を「CST SignalStar Secondary Imaging Round 2」に変更し、省略名「CST Sec Rd2」を追加してください。

11. 「Show wash steps」を選択してください。

12.	ステップ1 - 28を削除し、セクション9.3「BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド2」に記載されているステップ1 - 10を追加してください。イメージングラウンド2

13. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。

14. 「Create Protocol」を選択してください。

15. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。

5 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

アッセイを正しく実行するために、各試薬は適切なBOND RXコンテナ中か、BOND Titration Kit (#OPT9049) のインサート中で使用する必要があります。BOND RX全自動免疫染色装置でSignalStarアッセイを行うために必要なコンテナまたはインサートの数は下表をご覧ください。

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX全自動免疫染色装置では、コンテナが過充填されていると「空」とみなされます。

いくつかのSignalStarソリューションに、複数のコンテナが割り当てられています。そのため、次のコンテナに移る際に、BOND RXソフトウェアがアラートを発します。しかし、プロトコールを中断する必要はなく、ユーザーが取るべきアクションもありません。

Solution	BONDコンテナ	必要なコンテナの数
Solution	BONDコンテナ	5スライド	10スライド
Primary Antibody Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Secondary Antibody Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Secondary Blocking Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Imaging Round 1 Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Amplification Solution 1	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Amplification Solution 2	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Ligation Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
10%中性緩衝ホルマリン液	BOND 7 mLオープンコンテナ	1	1
0.1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	3	4
1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	1	1

5.1 Primary Antibody Solution

一次抗体の希釈液と一次抗体は、このキットには含まれていません。一次抗体は、推奨される希釈液を用いてメーカーが推奨する希釈倍率に調整してから使用してください。最終的な容量が、下の表の記載内容に合致することを確認してください。

一次抗体を購入する際は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で検証済みであることを確認してください。IHC-P検証済み抗体の包括的なカタログはwww.cellsignal.jpでご覧いただけます。

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の一次抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。同じ宿主種由来の一次抗体は組み合わせないでください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
一次抗体希釈液 (例：SignalStain® Antibody Diluent #8112)
各一次抗体 (例：FoxP3 (D2W8ETM) Rabbit Monoclonal Antibody #98377)
総量	1,122	1,887

5.2 Primary Antibody Solution

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の抗体を検出するための二次抗体および相補的オリゴをすべて組み合わせます (例：抗ラビット、抗マウス、抗ラット)。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各二次抗体 - SignalStar標識抗体	11	18.5
各二次抗体 - 相補的オリゴ	11	18.5
総量	最大1,166	最大1,961

5.3 Secondary blocking Solution

2種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：各宿主種の抗体に適合する二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体をすべて組み合わせてください (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体)。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体	5.5	9.3
総量	最大1,116.5	最大1,877.9

5.4 Imaging Round 1 Solution

調製後のSignalStar Imaging Round 1 Solutionには、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大7種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページのセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

同じ蛍光チャンネルの相補的オリゴを組み合わせないでください。イメージングラウンド1およびイメージングラウンド2に用いる相補的オリゴを混合しないでください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStarAntibody Diluent A	770	1,295
SignalStarAntibody Diluent B	330	555
各SignalStarオリゴ標識抗体	11	18.5
各イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo	11	18.5
総量	1,210	2,035

5.5 イメージングラウンド1：Amplification Solution 1

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。低吸着ピペットチップを用いて、SignalStarキットの構成品を15 mLコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を確保するために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。必要に応じて、2つのタイトレーションインサートに均等に分注してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

10スライドを実行する際は、まず15 mLコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサートに均等に分注してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

5.6 イメージングラウンド1：Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

5.7 イメージングラウンド1：Ligation Solution

以下の試薬を、1つのBONDタイトレーションインサート中で混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保持して速やかに使用してください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	550	925
Nuclease-free Water #12931	517	869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	22	37
ATP (100 mM)	11	18.5
総量	1,100	1,850

5.8 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、5 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH₂Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドあたり2コンテナ、10スライドあたり3コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、50 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH₂Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
10%中性緩衝ホルマリン液：研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

6 SignalStarイメージングラウンド1：BOND RXプロトコール

6.1 スライドベーキング

	スライドベーキングは、実験開始の前日に行うことができます。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	1. スライドを、60°Cで30分間以上インキュベートしてください。

6.2 BOND RXプロトコールの実行

	BOND RXを実験日の午後に設定し、一晩かけて実行するとワークフローが簡単になります。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	速やかにBOND RX染色を実行してください。遅延スタートは使用しないでください。染色完了後、スライドをBOND RX全自動免疫染色装置上に一晩置いておくことができます。
	2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
	3. 「adding slides」を選択する際に、BOND上での組織の調製用に以下を選択してください。 Slide preparation: Dewax Dispense Volume:150 µL HIER: ER2 40 min
	4. プロトコールとして「SignalStar Secondary Imaging Round 1」を選択し、各スライドについて「HIER ER2 40 min」を選択してください。
	5. ラベルを印刷してスライドに貼り、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
	6. BONDカバータイルをスライド上に置き、トレーの適切な位置に設置されていることを確認してください。
	SignalStar Secondary Imaging Round 1プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション9.2に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
	以下の各0.1X TBST洗浄ステップが「Open」にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが「Open」でない場合には、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStar Amplification Solution 1が6ステップ、SignalStar Amplification Solution 2が6ステップあることを確認してください。
	bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
	7. BOND RXを実行してください。
	8. BOND RX全自動免疫染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
	9. BOND RX全自動免疫染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。ルーチンの手順に従ってカバータイルを洗浄してください。
	10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	11. DAPI溶液で対比染色してください。
	12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
	13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。
	脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外す際は、いかなる時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。
	イメージング完了後すぐに、次のラウンドのイメージングが行えるように蛍光シグナルをスライドから取り除くことができます。イメージングラウンド2は、イメージングラウンド1に続いて可能な限り速やかに行ってください。

7 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。本書のセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後、使用中は氷上で保持してください。

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX全自動免疫染色装置では、コンテナが過充填されていると「空」とみなされます。

いくつかのSignalStarソリューションに、複数のコンテナが割り当てられています。そのため、次のコンテナに移る際に、BOND RXソフトウェアがアラートを発します。しかし、プロトコールを中断する必要はなく、ユーザーが取るべきアクションもありません。

試薬	BONDコンテナ	必要なコンテナの数
試薬	BONDコンテナ	5スライド	10スライド
蛍光除去液	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Imaging Round 2 Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Amplification Solution 1	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Amplification Solution 2	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Ligation Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
10%中性緩衝ホルマリン液	BOND 7 mLオープンコンテナ	1	1
0.1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	3	4
1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	1	1
SignalStar Fluorescent Removal Solution	BOND 6 mL Titration Instert	1	1

7.1 Fluorescence Removal Solution

1つのBONDタイトレーションインサート中で以下の試薬を混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保持してください。SignalStar溶液は、目的の実験用の試薬をすべて混合したら速やかに使用してください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
10X dsDNase Buffer	185	335
dsDNase	18.5	33.5
Nuclease-free Water #12931	1,646.5	2,981.5
総量	1,850	3,350

7.2 Imaging Round 2 Solution

調製後のSignalStar Imaging Round 2 Solutionは、イメージングラウンド2用の相補的オリゴを含んでいる必要があります。本書のセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

Imaging Round 2 Solutionに、SignalStar標識抗体を加えないでください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo	11	18.5
総量	最大1,144	最大1,924

7.3 イメージングラウンド2：Amplification Solution 1

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

7.4 イメージングラウンド2：Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

7.5 イメージングラウンド2：Ligation Solution

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	550	925
Nuclease-free Water #12931	517	869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	22	37
ATP (100 mM)	11	18.5
総量	1,100	1,850

7.6 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、5 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH₂Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドあたり3コンテナ、および10スライドあたり4コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)：1X TBST 500 mLを調製する場合、50 mLのTris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH₂Oに加えてください。30 mL BONDオープンコンテナ (5スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
10%中性緩衝ホルマリン液：研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

8 SignalStarイメージングラウンド2：BOND RXプロトコール

	各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液の調製前に、セクション5の「SignalStarイメージングラウンド1：使用プロトコール」をお読みください。
	SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施してください。このページのセクション10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

8.1 カバーガラスの除去

	1. SignalStarイメージングラウンド1のイメージング後に、スライドをdH₂O中に>30分間浸してからカバーガラスを穏やかに除去してください。
	脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外す際は、いかなる時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。

8.2 BOND RXプロトコールの実行

	BOND RXを実験日の午後に設定し、一晩かけて実行するとワークフローが簡単になります。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	速やかにBOND RX染色を実行してください。遅延スタートは使用しないでください。染色完了後、スライドをBOND RX全自動免疫染色装置上に一晩置いておくことができます。
	2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
	3. 「adding slides」を選択する際に、BOND上での組織の調製用に以下を選択してください。 Slide preparation:-- (no value/not required) Dispense Volume:150 µL HIER:-- (no value/not required)
	4. 「CST SignalStar Secondary Imaging Round 2」を選択して、スライド調製とHIERで「--」が選択されていることを確認してください。
	5. ラベルを印刷してスライドに貼って、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
	6. BONDカバータイルをのせる前に、2 - 3滴のdH₂Oを各スライド上に添加してください。
	重要：DewaxおよびHIER (抗原賦活化) は、増幅ラウンド2には必要ありません。DewaxおよびHIERを行った場合、増幅ラウンド2の結果が解釈不能になる可能性があります。
	Imaging Round 2プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション9.3に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
	以下の各0.1X TBST洗浄ステップが「Open」にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが「Open」でない場合には、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStar Amplification Solution 1が6ステップ、SignalStar Amplification Solution 2が6ステップあることを確認してください。
	bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
	7. BOND RXを実行してください。
	8. BOND RX全自動免疫染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
	9. BOND RX全自動免疫染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。ルーチン手順に従ってカバータイルを洗浄してください。
	10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	11. DAPI溶液で対比染色してください。
	12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
	13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。

9 ユーザーワークシート

9.1 SignalStarパネルデザインワークシート

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	製品ペア＃	イメージングラウンド	488	594	647	750

(Appendix 10.1のパネルデザインの例をご覧ください。)

9.2 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1

BOND 手順	✔	試薬	ステップの種類	インキュベーション時間	温度 (C)	分注タイプ
1	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
2	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
3	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
4	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	150 uL
5	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	150 uL
6	□	Primary Antibody Solution	試薬	40:00	室温	150 uL
7	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
8	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
9	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
10	□	Secondary Antibody Solution	試薬	40:00	室温	150 uL
11	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
12	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
13	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
14	□	Secondary Blocking Solution	試薬	40:00	室温	150 uL
15	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
16	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
17	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
18	□	10%中性緩衝ホルマリン液	試薬	5:00	室温	150 μL
19	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
20	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
21	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
22	□	MARKER (Imaging Round 1 Solution)	一次	40:00	室温	150 µL
23	□	1X TBST Solution	試薬	5:00	室温	オープン
24	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
25	□	10%中性緩衝ホルマリン液	試薬	5:00	室温	150 µL
26	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
27	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
28	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
29	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
30	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
31	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
32	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
33	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
34	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
35	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
36	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
37	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
38	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
39	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
40	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
41	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
42	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
43	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
44	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
45	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
46	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
47	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
48	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
49	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
50	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
51	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
52	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
53	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
54	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
55	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
56	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
57	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
58	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
59	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
60	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
61	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
62	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
63	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
64	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
65	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
66	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
67	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
68	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
69	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
70	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
71	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
72	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
73	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
74	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
75	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
76	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
77	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
78	□	Ligation Solution	試薬	20:00	室温	150 µL
79	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
80	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
81	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
82	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
83	□	BOND Wash Solution	洗浄	0:00	室温	150 µL

9.3 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド2

BONDステップ	✓	試薬	ステップの種類	インキュベーション時間 (分)	温度 (℃)	分注タイプ
1	□	0.1X TBST Solution	洗浄	0:00	室温	オープン
2	□	0.1X TBST Solution	洗浄	0:00	室温	オープン
3	□	Fluorescence Removal Solution	試薬	60:00	37°	150 µL
4	□	Fluorescence Removal Solution	試薬	60:00	37°	150 µL
5	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
6	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
7	□	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
8	□	MARKER (SignalStar Imaging Round 2 Solution)	一次	40:00	室温	150 µL
9	□	1X TBST溶液	試薬	5:00	室温	オープン
10	□	0.1X TBST Solution	試薬	5:00	室温	オープン
11	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
12	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
13	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
14	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
15	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
16	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
17	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
18	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
19	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
20	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
21	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
22	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
23	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
24	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
25	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
26	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
27	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
28	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
29	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
30	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
31	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
32	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
33	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
34	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
35	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
36	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
37	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
38	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
39	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
40	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
41	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
42	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
43	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
44	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
45	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
46	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
47	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
48	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
49	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
50	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
51	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
52	□	Amplification Solution 1	試薬	8:00	室温	150 µL
53	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
54	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
55	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
56	□	Amplification Solution 2	試薬	16:00	室温	150 µL
57	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
58	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
59	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
60	□	Ligation Solution	試薬	20:00	室温	150 µL
61	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
62	□	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
63	□	BOND Wash Solution	洗浄	0:00	室温	150 µL

10 Appendix

10.1 SignalStarパネルデザインの例

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	製品ペア＃	イメージングラウンド	488	594	647	750
Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Antibody	相補的オリゴ (CO-0055-488)	30599	1	•
PD-L1 (E1L3N^®) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0005)	相補的オリゴ (CO-0005-594)	28249	1		•
TIM-3 (D5D5R™) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0010)	相補的オリゴ (CO-0010-647)	15231	1			•
Ki-67 (8D5) Mouse Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0014)	相補的オリゴ (CO-0014-750)	56398	1				•
CD8α (D8A8Y) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0004)	相補的オリゴ (CO-0004-488)	45747	2	•
CD68 (D4B9C) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0007)	相補的オリゴ (CO-0007-594)	77318	2		•
CD20 (E7B7T) Rabbit Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0011)	相補的オリゴ (CO-0011-647)	36775	2			•
Pan-Keratin (C11) Mouse Monoclonal Antibody (SignalStar™ Conjugate 0003)	相補的オリゴ (CO-0003-750)	97227	2				•

10.2 トラブルシューティングとよくある質問

SignalStar Multiplex IHCキット&試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーでお選びいただける各抗体を厳密に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、この蛍光アッセイの基礎となるため、従来の発色アッセイで使用される親抗体についても厳密に試験しています。すべてのマルチプレックス構成や組織を試験することはできません。ご質問がありましたら、カスタマーサポートまでお問い合わせください。

このアッセイは凍結組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、凍結組織での使用に対してはまだ検証されていません。現在、凍結組織で使用するための抗体とプロトコールを検証中です。

抗マウス抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで「Mouse」を選択すると、抗マウス抗体のリストが表示されます。

利用可能な抗体のリストに目的の標的が見当たりません。それでも何らかの方法で、パネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCキット&試薬は、リストに含まれない抗体との使用に対してはまだ検証されていません。現在、SignalStar Multiplex IHCアッセイで、お客様の抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

SignalStar mIHCは、非破壊技術です。したがって、SignalStarアッセイ後に、同じ組織で目的の抗体を使用した直接免疫蛍光染色を行うことができます。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去し、そのまま直接免疫蛍光染色を行って可視化できます。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、直接標識済み抗体との併用について検証済みです。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、SignalStar mIHCの直後にそのまま免疫蛍光染色を行うことができます。この方法で、強力な細胞表面マーカーに対する多くの直接標識抗体が機能することが分かっています。詳細は、この春のAACRで発表された最新のポスターをご覧ください。さらに、直接免疫蛍光染色イメージングに使用可能な、弊社の直接標識抗体の製品ラインナップもご覧ください。

連続切片のSignalStar染色を発色染色と比較すると、より多くの陽性細胞が観察されます。この過剰な染色が正しいかどうかを、どのように確認すればよいですか？

最適化の過程で、蛍光染色は発色染色よりも高い陽性率を示す可能性があることが分かりました。過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色との共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8^陽性細胞がCD3^陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8^陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

イメージングラウンド1は、染色完了後、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。イメージングラウンド2では、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最長8時間は強いシグナルを示すと考えられます。

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬を使う際に、使用を予定している組織での最適化を行う必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキット&試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。組織の品質や標的の発現レベルは様々であるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどの調整を行うことにより、実験で最適なシグナルを取得できます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？

各標的について、発色IHCで陽性であることが示されたあらゆる組織が、ポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを使用してください。

このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？

最適な結果を得るためにも、SignalStarのプロトコールから逸脱は推奨できません。しかし、プロトコールに詳述されている抗原賦活化方法を使えない場合は、蛍光シグナルが減少しますが、電子レンジを使用してもよいかもしれません。存在量が少ない標的を検出する場合は、電子レンジの使用は推奨できません。この方法では結果の保証はできません。

電子レンジを使用した抗原賦活化を行うには：

1X EDTA Unmasking Solutionを用意してください：1X EDTA Unmasking Solution 250 mLを調製する場合、SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) 25 mLを精製水 (dH2O) 225 mLで希釈してください。スライドを1X EDTA Unmasking Solutionの入った容器に浸し、沸騰直前の温度まで電子レンジで加熱してください (出力レベル10で約2.5分間)。沸騰直前の温度 (95-98°C) で15分間加熱してください。ほとんどの一般的な電子レンジでは、これはパワーレベル3で8分間、パワーレベル2で7分間になります。その後、電子レンジから取り出し、スライドのコンテナをdH2Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH2Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。その後の冷却は必要ありません。

脂肪組織、脳組織、正常腎臓組織など、自家蛍光を多く持つ組織に対して、このアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

弊社は、最適化の過程で多種多様な腫瘍や組織タイプを活用していますが、すべての組織や発現レベルを考慮することはできません。推奨プロトコールに従えば、このアッセイはFFPE組織 (厚さ4-5 uM) でも機能するはずです。また、このアッセイでは、高い増幅機能により強力かつ特異的なシグナルが得られるため、自家蛍光が非常に高いレベルの組織であっても解析できる可能性があります。

ProLong Gold Antifade Reagent #9071の代わりに、別の封入剤を使用することはできますか？

このプロトコールには、ProLong Antifade封入剤が最適です。社内試験により、SlowFade Antifade Reagentはシグナル強度に悪影響があることが分かっています。

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作成日：2024年10月

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