Leica Biosystems社のBOND RX自動染色装置で行うSignalStar™マルチプレックス免疫組織化学染色に使用するSignalStar™ Secondary Antibodyキット

製品情報：

保存：キットのすべての構成品を-20°Cで保存してください。

安定性：キットのすべての構成品は、推奨された温度で保存した場合、少なくとも12 か月間安定性を維持します。5回を超える凍結/解凍サイクルは、行わないでください。

適用：SignalStarキットは、蛍光マルチプレックス免疫組織化学染色を行う際にご使用いただけます。

スライド数：このキットには、10枚のスライドの染色に必要な材料が含まれています。

1 はじめに：SignalStar染色の方法論
2 溶液および試薬
3 開始前の重要な考慮事項
4 BOND RX自動染色装置の設定
5 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製
6 SignalStarイメージングラウンド1：BOND RXプロトコール
- 6.1 スライドベーキング
- 6.2 BOND RXプロトコールの実行
7 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製
8 SignalStarイメージングラウンド2：BOND RXプロトコール
- 8.1 カバーガラスの除去
- 8.2 BOND RXプロトコールの実行
9 ユーザーワークシート
10 付録
- 10.1 SignalStarパネルデザインの例
- 10.2 トラブルシューティングとよくある質問

1 はじめに：SignalStar染色の方法論

SignalStarマルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) は、抗体、オリゴヌクレオチド (オリゴ)、蛍光色素を使用して、細胞の存在、位置、機能、またバイオマーカーの共発現パターンを探索します。SignalStar技術は、空間的な配置と組織の構造を保持しつつ、複数の標的の表現型および機能を検出できます。細胞が、どのようにして組織化し、疾患進行や治療への応答を制御する組織の微小環境に影響を与えるかを理解するためには、これらの知見が不可欠です。

SignalStarシステムの能力の源は、SignalStarに用いる抗体のデザインに存在します。これらの抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織で用いるために厳密に検証されており、その後、部位特異的な標識と徹底した精製法を用いて各オリゴヌクレオチド (オリゴ) タグに結合させます。高度に特異的な、相補的オリゴのネットワークと蛍光色素を用いることにより、科学者は、存在量が低いものも含めて3-8種類の標的のシグナルを増幅できます。

図 1： ご希望のプレックスサイズ (最大3-8種類のオリゴ標識抗体) のすべての抗体のカクテルを、1回の一次抗体インキュベーションステップの際に同時に添加します。蛍光色素標識済みの相補的オリゴ (チャンネル：488、594、647、750) を用いて、オリゴ-蛍光色素のコンストラクトを構築して抗体に結合させることにより、1回目のイメージングラウンドで最大4種類のオリゴ標識抗体のシグナルが増幅できます。プレックスのサイズが4より大きい場合は、1ラウンド目のオリゴと蛍光色素分子を穏やかに除去し、2ラウンド目で、最大4種類の追加のオリゴ標識抗体を可視化するための増幅を行います。この相補的なオリゴシステムと蛍光色素の除去プロセスにより、交差反応を示すことなく、同じ基質を用いて2ラウンド目の抗体シグナルを増幅できます。その後、お手持ちの、または無料のソフトウェアを用いて、コンピューター上で2つの画像を結合し、最大8種類の標的で構成される画像を作成することができます。

2 溶液および試薬

2.1 キットに含まれる構成品

SignalStar™ Secondary Antibody Kitに含まれる構成品

最大3種類のSignalStarオリゴ標識二次抗体 (以下を参照)

最大3種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)

二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Multiplex IHC Buffer Kitに含まれる構成品

最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (以下を参照)

最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (以下を参照)

SignalStar™ Antibody Diluent A

SignalStar™ Antibody Diluent B

SignalStar™ Amplification Buffer A

SignalStar™ Amplification Buffer B

SignalStar™ Amplification Oligo Set A：

488

594

647

750

SignalStar™ Amplification Oligo Set B：

488

594

647

750

SignalStar™ Ligation Buffer

T4 DNA Ligase (5 U/µL)

ATP (100 mM)

10X dsDNase Buffer

dsDNase

キットには、ご注文時にお選びいただいた最大8種類のSignalStarオリゴ標識抗体 (A) および最大8種類のSignalStar相補的オリゴ (B) が含まれており、これらはオリゴ-抗体ペア (C) として共に梱包されています。以下の例をご参照ください。

SignalStarオリゴヌクレオチド標識抗体

2.2 キットに含まれない必要な試薬

重要：SignalStar secondary antibodyの検出に必要な一次抗体
重要：SignalStain® Antibody Diluent #8112またはその他の推奨一次抗体希釈液
Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997
DAPI #4083
ProLong Gold Antifade Reagent #9071
Nuclease-free Water #12931
10%中性緩衝ホルマリン液
低吸着ピペットチップ

2.3 キットに含まれない必要な試薬 (Leica Biosystems社から入手可能)

BOND Research Detection System #DS9455
BOND Aspirating Probe Cleaning Kit #CS9100
BOND Titration Kit (10 containers, 50 inserts) #OPT9049
BOND Open Containers 30 mL (10 pack) #OP309700
BOND Open Containers 7 mL (10 pack) #OP79193
BOND Universal Covertiles (160 pack) #S21.4611
BOND TM Epitope Retrieval 2-1 L (RTU) #AR9640
BOND Dewax Solution 1 L (RTU) #AR9222
BOND Wash Solution 10X Concentrate, 1L #AR9590

3 開始前の重要な考慮事項

実験の開始前に、溶液調製のステップおよびプロトコール全体をお読みください。

同じチャンネルの相補的オリゴを組み合わせて使用しないでください。 1回のイメージングラウンドに含めることができる、各蛍光チャンネルの相補的オリゴは1つのみです。同じイメージングラウンドで同じ蛍光チャンネルに特異的な相補的オリゴを組み合わせると、アッセイの結果が解釈不能になる可能性があります。

異なるパネルの抗体を組み合わせないでください。 同時に複数のパネルを実行する場合は、パネルごとに個別の抗体/相補的オリゴの混合物を作成する必要があります。

一部のSignalStarキットの構成品には粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。 SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。 コンテナやプロトコール、新しいBOND Research Detection Systemを作成してください。このプロトコールの実行には、BOND Research Detection Systemが必要です。

SignalStarアッセイの各ラウンドが完了したら、毎回BOND RXの吸引プローブの洗浄を行ってください。

SignalStarパネルデザインが‭2ラウンドのイメージングを必要とするか否かを確認してください。 このページの10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

使用を予定している顕微鏡が、本キットに含まれる蛍光色素を検出できるかを確認してください。 イメージングの際に、DAPIに加えて4蛍光チャンネルが必要になります。機器の設定については、各プロバイダーに確認してください。

蛍光チャンネル	励起波長 (nm)	放射波長 (nm)	レーザー線	一般的なフィルターセット
488	488	520	488	FITC
594	590	618	561/594	Texas Red
647	650	668	594/633	Cy^®5
750	752	776	633	Cy^®7

染色が完了してから8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。 この時間内にスライドのイメージングが行われない場合、蛍光シグナルが消失する可能性があります。

単染色した各スライドを、同じ蛍光チャンネルを用いてイメージングし、スペクトルライブラリーを作成することを推奨します。 これにより、スペクトルの漏れ込みの最小化に役立つ、スペクトルの分離が可能になります。

DAPIを含む封入剤ではなく、DAPI濃縮液の使用を推奨します。 明るいDAPI染色は、より良い画像の結合に役立ちます。

このプロトコールから逸脱した場合、結果は保証できません。 SignalStarプロトコールは、指定された抗原除去と染色ステップに合わせて開発および最適化されています。

ポジティブコントロールスライドの使用を推奨します。 マルチプレックスパネル内のすべての標的が存在することが発色染色で確認済みの組織を、各染色に含めることを推奨します。

各抗体を1:100で使用することを推奨します。 ただし、1:50または1:200希釈のいずれかで使用した場合でも十分な量の抗体試薬を提供しています。

次のSignalStarキット構成品は、使用前に一晩4℃で解凍できます。

SignalStar™ Antibody Diluent A
SignalStar™ Antibody Diluent B
SignalStar™ Amplification Buffer A
SignalStar™ Amplification Buffer B
SignalStar™ Ligation Buffer

4 BOND RX自動染色装置の設定

溶液の調製前に、BOND RXソフトウェアを用いてプロトコールと試薬の設定を行ってください。BOND RXソフトウェアバージョン7.0以上が必要です。

4.1 BOND RX自動染色装置上での新たな試薬の調製

以下の試薬は、SignalStarアッセイ用にBOND RXで調製する必要があります。

BONDタイトレーションコンテナ

	1. Primary Antibody Solution
	2. Secondary Antibody Solution
	3. Secondary Blocking Solution
	4. MARKER (= SignalStar Staining Solution)
	5. Amplification Solution 1
	6. Amplification Solution 2
	7. Ligation Solution
	8. Fluorescence Removal Solution

BOND 7 mLオープンコンテナ

	9. 10%中性緩衝ホルマリン液
	10%中性緩衝ホルマリン液を作成する際は、「Hazardous」を選択し、廃液が適切に廃棄されることを確認してください。

BOND 30 mLオープンコンテナ

	10. 0.1X TBST
	11. 1X TBST (BOND Research Detection Systemへの連結に必要です)

4.2 BOND Research Detection Systemの設定

	1. 「CST SignalStar」と名付けた新しいBOND Research Detection Systemを作成してください。
	2. 1X TBSTを含む30 mLオープンコンテナをCST SignalStar BOND Research Detection Systemに連結してください。
	ステップ2のオープンコンテナには明確な名称をつけてください (例えば「0.1X TBST」ではなく「1X TBST」)。

4.3 SignalStarイメージングラウンド1およびイメージングラウンド2用のBOND RXプロトコールの作成

1. BOND RXソフトウェアで、「Protocol Setup」を選択してください。

2. 「*IF Protocol」を選択してください。(「Modified by」カラムにLeicaが表示されていることを確認してください。)

3. プロトコールをコピーして作成し、「CST SignalStar Secondary Imaging Round 1」に名称を変更してください。省略名の「CST Sec Rd1」を追加してください。

4. 「Show wash steps」を選択してください。

5.	すべてのステップを削除し、「BOND RX プロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1」のセクション 9.2 に記載されているステップを加えてください。

6. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。

7. 「Create Protocol」を選択してください。

8. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。

9. 「CST SignalStar Secondary Imaging Round 1」プロトコールのコピーを作成してください。

10. コピーのファイル名を「CST SignalStar Secondary Imaging Round 2」に変更し、省略名「CST Sec. Rd2」を追加してください。

11. 「Show wash steps」を選択してください。

12.	ステップ1-28を削除し、「BOND RX プロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド2」のセクション9.3に記載されているステップ1-10を追加してください。イメージングラウンド2

13. 適合検出システムは「CST SignalStar」を選択してください。

14. 「Create Protocol」を選択してください。

15. 注意書きに同意するため、「Save」と「Yes」をクリックしてください。

5 SignalStarイメージングラウンド1：溶液の調製

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液を調製する前に、SignalStarイメージングラウンド1：セクション6の全プロトコールをお読みください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後使用中は氷上で保管します。

‭アッセイを正しく実行するために、各試薬は適切なBOND RXコンテナ中か、BOND Titration Kit (‭‭#OPT9049‭‬) のインサート中で‭使用する必要があります。 BOND RX自動染色装置でSignalStarアッセイを行うために必要なコンテナまたはインサートの数は下表をご覧ください。

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX自動染色装置は、コンテナが過充填されていると「Empty」とみなします。

いくつかのSignalStarソリューションに、複数のコンテナが割り当てられています。 そのため、次のコンテナに移る際に、BOND RXソフトウェアがアラートを発します。しかし、プロトコールを中断する必要はなく、ユーザーが取るべきアクションもありません。

Solution	BONDコンテナ	必要なコンテナの数
Solution	BONDコンテナ	5スライド	10スライド
Primary Antibody Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Secondary Antibody Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Secondary Blocking Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Imaging Round 1 Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Amplification Solution 1	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Amplification Solution 2	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Ligation Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
10%中性緩衝ホルマリン液	BOND 7 mLオープンコンテナ	1	1
0.1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	3	4
1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	1	1

5.1 Primary Antibody Solution

一次抗体の希釈液と一次抗体は、このキットには含まれていません。 推奨される希釈液のメーカーが推奨する希釈で、一次抗体を使用してください。最終的な容量が、下の表の記載内容に合致することを確認してください。

一次抗体を購入する際は、ホルマリン固定パラフィン包理組織で検証済みであることをご確認ください。 IHC-P検証済み抗体の包括的なカタログはwww.cellsignal.comでご覧いただけます。

1種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる宿主種由来の一次抗体 (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。同じ宿主種由来の一次抗体は組み合わせないでください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
Primary Antibody Diluent (例：SignalStain® Antibody Diluent #8112)
各一次抗体 (例：FoxP3 (D2W8ETM) Rabbit mAb #98377)
総量	1,122	1,887

5.2 Primary Antibody Solution

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を、低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合したら、SignalStar溶液を室温で保存して速やかに使用してください。

1種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：異なる由来種を検出するための二次抗体および相補的オリゴをすべて組み合わせます (例：抗ラビット、抗マウス、抗ラット)。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各二次抗体 - SignalStar標識抗体	11	18.5
各二次抗体 - 相補的オリゴ	11	18.5
総量	最大1,166	最大1,961

5.3 Secondary blocking Solution

1種類以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合： 1つ以上の一次抗体および二次抗体を使用する場合：含まれた異なる由来種の二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体をすべて組み合わせます (例：ラビットモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体) をすべて組み合わせます。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各二次ブロッキングアイソタイプコントロール抗体	5.5	9.3
総量	最大1,116.5	最大1,877.9

5.4 Imaging Round 1 Solution

調製後の溶液には、キットのご注文時にお選びいただいたすべての抗体 (イメージングラウンド1とイメージングラウンド2を合わせて最大7種類) と、イメージングラウンド1の相補的オリゴが含まれている必要があります。このページの10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

同じチャンネルの相補的オリゴを組み合わせて使用しないでください。 1回目のイメージングラウンドおよび2回目のイメージングラウンドに用いる相補的オリゴを混合しないでください。

SignalStar Antibody Diluentには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を、低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各SignalStarオリゴ標識抗体	11	18.5
各イメージングラウンド1：SignalStar Complementary Oligo	11	18.5
総量	1,210	2,035

5.5 イメージングラウンド1：Amplification Solution 1

SignalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。必要に応じて、2つのタイトレーションインサートに均一に分割してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

10スライドを実行する際は、まず15 mLコニカルチューブ内で総量を作成し、20分間ローテーターで混合した後、2つのタイトレーションインサートに均等に分注してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

5.6 イメージングラウンド1：Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

5.7 イメージングラウンド1：Ligation Solution

以下の試薬を、1つのBONDタイトレーションインサート中で混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上に保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	550	925
Nuclease-free Water #12931	517	869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	22	37
ATP (100 mM)	11	18.5
総量	1,100	1,850

5.8 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 1X TBST 500 mLを調製する場合は、5 mLのTris Buffered Saline with Tween20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH₂Oに加えてください。30 mLのBONDオープンコンテナ (2スライドあたり5コンテナ、3スライドあたり10コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
1X Tris Buffered Saline with Tween20 (TBST)： 1X TBST 500 mLを調製する場合は、50 mLのTris Buffered Saline with Tween20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH₂Oに加えてください。30 mLのBONDオープンコンテナ (5 スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
10%中性緩衝ホルマリン： 研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

6 SignalStarイメージングラウンド1：BOND RXプロトコール

6.1 スライドベーキング

	実験開始の前日にスライドベーキングを行うことができます。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	1. スライドを、60°Cで30分間以上インキュベートしてください。

6.2 BOND RXプロトコールの実行

	BOND RXを当日の午後に設定し、一晩かけて実行するとワークフローが簡単になります。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	速やかにBOND RX染色実行を開始し、遅延スタートは使用しないでください。染色が完了後、スライドをBOND RX自動染色装置上に一晩置いておくことができます。
	2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
	3. 「スライドを追加」する際に、BOND上での組織の調製用に、以下を選択してください。スライドの調製：ワックスの除去分注量：150 µL 加熱処理：ER2 40min
	4. 各スライドについて、プロトコール欄で「SignalStar Secondary Imaging Round 1」と「HIER ER2 40 min」を選択してください。
	5. ラベルを印刷してスライドに貼り、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
	6. BONDカバータイルをスライド上に置き、トレーの適切な位置に設置されていることを確認してください。
	SignalStar Secondaryイメージングラウンド1プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション 9.2に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
	以下の各0.1X TBST洗浄ステップが「Open」にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが「Open」でない場合には、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。6回のSignalStar Amplification Solution 1ステップおよび6回のSignalStar Amplification Solution の合計2ステップがあることを確認してください。
	bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
	7. BOND RXを実行してください。
	8. BOND RX自動染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
	9. BOND RX自動染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。毎回、カバータイルを洗浄してください。
	10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	11. DAPI溶液で対比染色してください。
	12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
	13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。
	脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外す際は、どの時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。
	イメージング完了後すぐに、次のラウンドのイメージングが行えるように、蛍光シグナルをスライドから取り除くことができます。イメージングの1ラウンド目に続いて、可能な限り速やかに2ラウンド目を行ってください。

7 SignalStarイメージングラウンド2：溶液の調製

各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液を調製する前に、SignalStarイメージングラウンド1：セクション8の全プロトコールをお読みください。

SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施します。このページの10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

SignalStarキット構成品は、特別な記載がない限り使用直前に室温で解凍し、その後使用中は氷上で保管します。

オープンコンテナを過充填しないでください。BOND RX自動染色装置は、コンテナが過充填されていると「Empty」とみなします。

いくつかのSignalStarソリューションに、複数のコンテナが割り当てられています。そのため、次のコンテナに移る際に、BOND RXソフトウェアがアラートを発します。しかし、プロトコールを中断する必要はなく、ユーザーが取るべきアクションもありません。

試薬	BONDコンテナ	必要なコンテナの数
試薬	BONDコンテナ	5スライド	10スライド
Fluorescence Removal Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Imaging Round 2 Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
Amplification Solution 1	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Amplification Solution 2	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	2
Ligation Solution	BOND 6 mLタイトレーションインサート	1	1
10%中性緩衝ホルマリン液	BOND 7 mLオープンコンテナ	1	1
0.1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	3	4
1X TBST Solution	BOND 30 mLオープンコンテナ	1	1
SignalStar Fluorescent Removal Solution	BOND 6 mL タイトレーションインサート	1	1

7.1 Fluorescence Removal Solution

1つのBONDタイトレーションインサート中で以下の試薬を混合してください。パラフィルムで蓋をし、10秒間ボルテックスしてください。溶液を調製する際は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上に保存してください。すべての試薬を混合したSignalStar溶液は、速やかに使用してください。

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
10X dsDNase Buffer	185	335
dsDNase	18.5	33.5
Nuclease-free Water #12931	1,646.5	2,981.5
総量	1,850	3,350

7.2 Imaging Round 2 Solution

調製後のSignalStar Imaging Round 2 Solutionは、イメージングラウンド2用の相補的オリゴを含んでいる必要があります。このページの10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

イメージングラウンド2溶液に、Signal Star標識抗体を加えないでください。

SignalStar Antibody Dilutには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、転倒混和してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Antibody Diluent A	770	1,295
SignalStar Antibody Diluent B	330	555
各イメージングラウンド2：SignalStar Complementary Oligo	11	18.5
総量	最大1,144	最大1,924

7.3 イメージングラウンド2：Amplification Solution 1

SigalStar Amplification Bufferには粘性があります。溶液量が正確に測定されていない場合、または十分に混合されていない場合、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。SignalStarキット構成品を低吸着ピペットチップを用いて15 mLのコニカルチューブに入れて混合してください。正確性を保つために、ゆっくりとピペッティングしてください。室温で20分間、ローテーターで転倒混和してください。必要に応じて、2つのタイトレーションインサートに均一に分割してください。使用時以外は、すべてのSignalStarキット構成品を氷上で保存してください。混合した後のSignalStar溶液は、室温で保存して速やかに使用してください。

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo A-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo A-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

7.4 イメージングラウンド2：Amplification Solution 2

キット構成品	必要な容量
キット構成品	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Amplification Buffer A	2,425	4,675
SignalStar Amplification Buffer B	2,425	4,675
SignalStar Amplification Oligo B-488	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-594	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-647	48.5	93.5
SignalStar Amplification Oligo B-750	48.5	93.5
総量	5,044	9,724

7.5 イメージングラウンド2：Ligation Solution

キット構成品/試薬	必要な容量
キット構成品/試薬	5スライド (µL)	10スライド (µL)
SignalStar Ligation Buffer	550	925
Nuclease-free Water #12931	517	869.5
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	22	37
ATP (100 mM)	11	18.5
総量	1,100	1,850

7.6 キットに含まれない、追加で用意する必要がある溶液

0.1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)： 1X TBST 500 mLを調製する場合は、5 mLのTris Buffered Saline with Tween20 (TBST-10X) #9997を495 mLのdH₂Oに加えてください。30 mLのBONDオープンコンテナ (3スライドあたり5コンテナ、4スライドあたり10コンテナ) に充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
1X Tris Buffered Saline with Tween20 (TBST)： 1X TBST 500 mLを調製する場合は、50 mLのTris Buffered Saline with Tween20 (TBST-10X) #9997を450 mLのdH₂Oに加えてください。30 mLのBONDオープンコンテナ (5 スライドまたは10スライドあたり1コンテナ) を充填してください。調製中の気泡の発生にご注意ください。
10%中性緩衝ホルマリン： 研究室のドラフト内で、7 mLのBONDオープンコンテナに充填してください。

8 SignalStarイメージングラウンド2：BOND RXプロトコール

	各溶液は、調製後すぐに使用してください。溶液を調製する前に、SignalStarイメージングラウンド1：セクション8の全プロトコールをお読みください。
	SignalStarイメージングラウンド2は、2つのイメージングラウンドを必要とする抗体パネルの場合のみ実施します。このページの10.1および9.1に記載しているSignalStarパネルデザインの例とSignalStarパネルデザインワークシートをお役立てください。

8.1 カバーガラスの除去

	1. SignalStarイメージングラウンド1のイメージング後に、スライドをdH₂O中に30分間以上浸してからカバースリップを穏やかに除去してください。
	脱パラフィン後、またはカバースリップを取り外す際は、どの時点でもスライドを乾燥させないようにしてください。

8.2 BOND RXプロトコールの実行

	BOND RXを当日の午後に設定し、一晩かけて実行するとワークフローが簡単になります。このステップでは、パラフィンワックスを融解させ、組織をスライドにより強く接着させます。
	速やかにBOND RX染色実行を開始し、遅延スタートは使用しないでください。染色が完了後、スライドをBOND RX自動染色装置上に一晩置いておくことができます。
	2. BOND RXソフトウェア上で新たな実験を作成し、スライドを追加してください。
	3. 「スライドを追加」する際に、BOND上での組織の調製用に、以下を選択してください。スライドの調製：-- (何も選択しないでください) 分注量：150 µL 加熱処理：-- (何も選択しないでください)
	4. 「CST SignalStar Secondary Imaging Round2」を選択して、スライド調製と加熱処理で「--」が選択されていることを確認してください。
	5. ラベルを印刷してスライドに貼って、そのスライドをBONDスライドトレーに設置してください。
	6. BONDカバータイルをのせる前に、2-3 滴のdH₂Oを各スライド上に添加してください。
	重要：デワックスおよび加熱処理 (抗原賦活化) は、増幅ラウンド2には必要ありません。Dewaxおよび加熱処理を行った場合、増幅ラウンド2の結果が解釈不能になる可能性があります。
	SignalStarイメージングラウンド2プロトコールの各ステップが正しく実行されていることを確認することは重要です。セクション 9.3に記載しているチェックリストを、プロトコールの作成にお役立てください。
	以下の各0.1X TBST洗浄ステップが「オープン」にセットされていることを確認してください。もし洗浄ステップが「Open」でない場合には、蛍光シグナルが変化または消失する可能性があります。6回のSignalStar Amplification Solution 1ステップおよび6回のSignalStar Amplification Solutionの合計2ステップがあることを確認してください。
	bulk Bond Wash Solutionコンテナが充填されており、廃液コンテナが空であることを確認してください。
	7. BOND RX実行を開始してください。
	8. BOND RX自動染色装置からスライドを取り出して、0.1X TBSTに浸してください。
	9. BOND RX自動染色装置上の吸引プローブ洗浄を実行してください。毎回、カバータイルを洗浄してください。
	10. データシートの指示に従って、DAPI #4083溶液を調製してください。
	11. DAPI溶液で対比染色してください。
	12. スライドを0.1X TBST中に30秒間浸してください。
	13. スライドをProLong Gold Antifade Reagent #9071で封入してください。
	14. 8時間以内にスライドのイメージングを行ってください。

9 ユーザーワークシート

9.1 SignalStarパネルデザインワークシート

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	製品ペア＃	イメージングラウンド	488	594	647	750

(付録10.1でパネルデザインの例をご覧ください。)

9.2 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド1

BOND 手順	✓	試薬	ステップの種類	インキュベーション時間	温度 (C)	分注量
1	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
2	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
3	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
4	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	150 uL
5	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	150 uL
6	☐	Primary Antibody Solution	試薬	40:00分	室温	150 uL
7	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
8	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
9	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
10	☐	Secondary Antibody Solution	試薬	40:00分	室温	150 uL
11	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
12	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
13	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
14	☐	Secondary Blocking Solution	試薬	40:00分	室温	150 uL
15	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
16	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
17	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
18	☐	10%中性緩衝ホルマリン液	試薬	5:00分	室温	150 uL
19	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
20	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
21	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
22	☐	マーカー (イメージングラウンド1ソリューション)	一次	40:00分	室温	150 µL
23	☐	1X TBST Solution	試薬	5:00分	室温	オープン
24	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
25	☐	10%中性緩衝ホルマリン液	試薬	5:00分	室温	150 µL
26	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
27	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
28	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	150 µL
29	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
30	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
31	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
32	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
33	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
34	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
35	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
36	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
37	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
38	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
39	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
40	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
41	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
42	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
43	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
44	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
45	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
46	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
47	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
48	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
49	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
50	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
51	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
52	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
53	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
54	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
55	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
56	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
57	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
58	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
59	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
60	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
61	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
62	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
63	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
64	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
65	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
66	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
67	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
68	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
69	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
70	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
71	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
72	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
73	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
74	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
75	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
76	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
77	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
78	☐	Ligation Solution	試薬	20:00分	室温	150 µL
79	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
80	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
81	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
82	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
83	☐	BOND Wash Solution	洗浄	0:00	室温	150 µL

9.3 BOND RXプロトコール設定チェックリスト：イメージングラウンド2

BONDステップ	✓	試薬	ステップの種類	インキュベーション時間	温度 (℃)	分注量
1	☐	0.1X TBST Solution	洗浄	0:00	室温	オープン
2	☐	0.1X TBST Solution	洗浄	0:00	室温	オープン
3	☐	Fluorescence Removal Solution	試薬	60:00分	37°	150 µL
4	☐	Fluorescence Removal Solution	試薬	60:00分	37°	150 µL
5	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
6	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
7	☐	*脱イオン化水	洗浄	0:00	室温	オープン
8	☐	MARKER (SignalStar Imaging Round 2 Solution)	一次	40:00分	室温	150 µL
9	☐	1X TBST Solution	試薬	5:00分	室温	オープン
10	☐	0.1X TBST Solution	試薬	5:00分	室温	オープン
11	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
12	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
13	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
14	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
15	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
16	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
17	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
18	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
19	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
20	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
21	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
22	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
23	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
24	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
25	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
26	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
27	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
28	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
29	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
30	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
31	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
32	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
33	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
34	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
35	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
36	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
37	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
38	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
39	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
40	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
41	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
42	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
43	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
44	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
45	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
46	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
47	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
48	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
49	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
50	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
51	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
52	☐	Amplification Solution 1	試薬	8:00分	室温	150 µL
53	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
54	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
55	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
56	☐	Amplification Solution 2	試薬	16:00分	室温	150 µL
57	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
58	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
59	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
60	☐	Ligation Solution	試薬	20:00分	室温	150 µL
61	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
62	☐	0.1X TBST Solution	試薬	0:00	室温	オープン
63	☐	BOND Wash Solution	洗浄	0:00	室温	150 µL

10 付録

10.1 SignalStarパネルデザインの例

オリゴ標識抗体	相補的オリゴ	製品ペア＃	イメージングラウンド	488	594	647	750
Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Antibody	相補的オリゴ (CO-0055-488)	30599	1	●
PD-L1 (E1L3N^®) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0005)	相補的オリゴ (CO-0005-594)	28249	1		●
TIM-3 (D5D5R™) XP^®Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0010)	相補的オリゴ (CO-0010-647)	15231	1			●
Ki-67 (8D5) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0014)	相補的オリゴ (CO-0014-750)	56398	1				●
CD8ɑ (D8A8Y) Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0004)	相補的オリゴ (CO-0004-488)	45747	2	●
CD68 (D4B9C) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0007)	相補的オリゴ (CO-0007-594)	77318	2		●
CD20 (E7B7T) XP^® Rabbit mAb (SignalStar™ Conjugate 0011)	相補的オリゴ (CO-0011-647)	36775	2			●
Pan-Keratin (C11) Mouse mAb (SignalStar™ Conjugate 0003)	相補的オリゴ (CO-0003-750)	97227	2				●

10.2 トラブルシューティングとよくある質問

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬はどのように検証されていますか？

CSTは、SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーでお選びいただける各抗体を厳密に検証しています。また、イメージングの両ラウンドにおいて、タイトレーションや蛍光色素との組み合わせを通じて、抗体の様々な条件を試験しています。試験は、様々な腫瘍や組織を用いて行います。また、従来の発色アッセイでも用いられるこれらの抗体は、この蛍光アッセイの基礎となるため、厳密に試験されています。すべてのマルチプレックス構成や組織をテストすることはできません。ご質問がありましたら、カスタマーサポートまでお問い合わせください。

このアッセイは凍結した組織で機能しますか？

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬は、凍結された組織での使用に対してはまだ検証されていません。現在、凍結組織で使用するための抗体とプロトコールを検証中です。

使用可能な抗マウス抗体はありますか？

SignalStar Multiplex IHCパネルビルダーの最初のステップで「Mouse」を選択すると、抗マウス抗体のリストが表示されます。

利用可能な抗体のリストに目的の標的が見当たりません。他の抗体をパネルに追加することができますか？

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬は、メニューに含まれない抗体との使用に対してはまだ検証されていません。現在、SignalStar Multiplex IHCアッセイで、お手持ちの抗体を使用するためのカスタムソリューションを開発中です。

SignalStar mIHCは、サンプルを破壊しない技術です。したがって、SignalStarアッセイ後に同じ組織で、目的の抗体を使用した直接免疫蛍光染色を行うことができます。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去し、直接、免疫蛍光染色で可視化できます。

このアッセイに用いる抗体と直接標識を組み合わせることはできますか？

SignalStar Multiplex IHCキットと試薬は、直接標識済み抗体と組み合わせての使用に対してはまだ検証されていません。SignalStar™ Fluorescence Removal Kit #32722を使えば、SignalStar mIHCの後に蛍光オリゴを除去して、SignalStar mIHCの直後に直接免疫蛍光染色を染色して可視化することができます。この方法で、強力な細胞表面マーカーに対する多くの直接標識抗体が機能することが分かっています。詳細は、この春のAACRで発表された最近のポスターをご覧ください。さらに、直接免疫蛍光染色イメージングに使用可能な、弊社の直接標識抗体の製品ラインをご覧ください。

連続切片のSignalStar染色を発色染色と比較すると、より多くの陽性細胞が見えます。この過剰な染色が正しいどうかを、どのように確認すれば良いですか？

最適化の過程で、蛍光染色は発色染色よりも高い陽性率を示す可能性があることが分かりました。過剰な染色が特異的であることを確認するには、細胞内局在や、他の染色と共局在性が正しいことを確認してください。例えば、すべてのCD8陽性細胞がCD3陽性である場合、発色染色と比較して過剰なCD8陽性細胞は、正しい染色である可能性が高くなります。

染色が完了してからスライドをイメージングするまで、スライドをどのぐらいの時間保存できますか？

1回目のイメージングラウンドは、染色完了後、最大8時間後までのイメージングにおいて強いシグナルを示すと考えられます。2回目のイメージングラウンドでは、イメージングは染色完了後に可能な限り速やかに行うべきですが、最大8時間後まではシグナルは強いと考えられます。

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、使用を予定している組織に対して最適化する必要がありますか？

SignalStar Multiplex IHCのキットと試薬は、蛍光色素の組み合わせと抗体の染色順について最適化されています。標的の特性と発現レベルは組織によって異なるため、パネル内の抗体濃度を2倍に増やす、または0.5倍に減らすなどと調整することにより、実験で最適なシグナルを取得できます。

このアッセイに含むべき適切なポジティブコントロールは何ですか？複数のコントロールが必要ですか？

各標的について、発色IHCで陽性であることことが示されたあらゆる組織が、ポジティブコントロール組織として機能します。標的ごとにポジティブコントロールが必要であるため、複数のコントロールが必要になる場合もあります。最適な比較を行うために、可能な限り連続切片に近いものを用いてください。

このプロトコールに記載されている方法以外の抗原賦活化を行うことはできますか？

最適な結果を得るためには、SignalStarのプロトコールから逸脱することはお勧めできません。しかし、プロトコールに詳述されている抗原賦活化方法を使えない場合は、蛍光シグナルが減少しますが、電子レンジを使用してみても良いかもしれません。存在量が低い標的を検出する場合は、電子レンジの使用はお勧めできません。この方法では結果の保証はできません。

電子レンジを使用した抗原賦活化をおこなうには：

1X EDTA賦活化溶液 mLを用意する：250 mLの1X EDTA Unmasking Solutionを調製する場合は、25 mLのSignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747) を225 mLのdH2Oで希釈してください。スライドを1X EDTA賦活化溶液の入った容器に浸し、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します (出力レベル10で約2.5分間)。煮沸直前の温度 (95 - 98°C) で15分間加熱します。ほとんどの一般的な電子レンジでは、これはパワーレベル3で8分間、パワーレベル2で7分間ということになります。その後電子レンジから取り出し、スライドのコンテナをdH2Oの蛇口の下に置き、EDTAがdH2Oに置換されるまでスライドコンテナに直接水を加えてください。その後の冷却は必要ありません。

脂肪組織や厚い脳組織切片、または正常な腎臓組織などの自家蛍光が高い組織でこのアッセイを行いたいと考えています。このアッセイがこれらの組織タイプで機能することを実証するサンプルデータはありますか？

私たちは最適化の過程で多種多様な腫瘍や組織タイプを活用していますが、すべての組織や発現レベルを考慮できるわけではありません。推奨プロトコールに従えば、このアッセイはFFPE組織 (厚さ4 - 5uM) でも機能するはずです。また、このアッセイでは、高い増幅機能により強力かつ特異的なシグナルが得られるため、自家蛍光が非常に高いレベルの組織であっても解析できる可能性があります。

ProLong Gold Antifade Reagent #9071の代わりに、別の封入剤を使用することはできますか？

このプロトコールには、Prolong Antifade封入剤が最適です。社内試験により、SlowFade Antifade Reagentはシグナル強度に悪影響があることが分かっています。

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更新：2024年10月

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