CUT&RUNのトラブルシューティングガイド

直面しているCUT&RUNの問題点を選択してくださいConcanavalin Aのビーズが実験中に凝集する精製されたDNAサンプルからPicoGreenによるDNA定量アッセイでDNAが検出されないqPCR解析あるいはNG-seq解析でシグナルがないqPCR解析あるいはNG-seq解析でバックグラウンドシグナルが高い

A：細胞のジギトニンに対する感受性の決定

CUT&RUNキットのプロトコールでは、バッファーにジギトニンを添加することで細胞膜の透過化を行い、一次抗体やpAG-MNase酵素が細胞や核に進入できるようにします。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の消化に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。CUT&RUNプロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコール用い、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。

実験開始前の準備：

• Digitonin Solution #16359 を取り出して、90 - 100°Cで5分間温めてください。必ず完全に解凍してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置いてください。

  注意：Digitonin Solution #16359は-20°Cで保管する必要があります。使用中は氷上に置き、使用が終了したら-20°Cで保管してください。

• 各細胞または組織サンプル当たり、Wash Bufferを100 µL (10X Wash Buffer #31415 10 µL + Nuclease-free Water #12931 90 µL) 調製してください。この試験では、スペルミジンやProtease Inhibitor Cocktailを加える必要はありません。

1. 1.5 mLチューブに10,000 - 100,000細胞を回収してください。組織の場合は、1 mgの組織から解離した細胞を回収してください (セクション I-C、ステップ 1-13)。固定した細胞や組織をCUT&RUN実験に使用する場合は、この試験でも同じ方法で細胞や組織の固定を行ってください。
2. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。

   注意：細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度になるべく多くの培地を除去し、培地をいくらか残すことを推奨します。続くステップ3で、適量の1X Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を100 µLにしてください。

3. Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 1反応当たり、 Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。
5. 細胞懸濁液10 µLと0.4% Trypan Blue 10 µLを混合してください。
6. 血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と総細胞数を計測してください。透過化が十分であれば、90%以上の細胞がTrypan Blueで染色されます。
7. Trypan Blueで染色された細胞数が90%未満の場合は、バッファーに加えるDigitonin Solution #16359 の量を増加させて、90%以上の細胞が透過化され染色されるまでステップ1 - 5を繰り返してください。セクションI-IVでは、この量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

B：インプットサンプルのソニケーションの最適化

DNAスピンカラムを使用して精製できるのは、10 kb以下に断片化されたゲノムDNAだけであることから、インプットDNAサンプルのソニケーションを推奨します。1 kb以下に断片化されたゲノムDNAは、NG-seq解析でネガティブコントロールとして使用できます。インプットDNAの長さが100-600 bpになるように、ソニケーションを最適化する必要があります。

NG-seqのコントロールには、インプットサンプルを使用することを推奨します。インプットサンプルは、偏りのない細胞ゲノムの代表として簡便に使用できるからです。IgGサンプルもNG-seqのネガティブコントロールとして使用できますが、非特異的な結合によりゲノムの特定領域で濃縮が見られる場合があります。qPCR解析の場合は、インプットDNAを断片化せずに使用することができます。ただし、断片化されていないDNAは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する必要があります。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、調製するインプットサンプルの数に比例して増加させる必要があります。

• DNA Extraction Buffer#42015を取り出して室温で温め、完全に解凍されて液状になっていることを確認してください。
• インプット1サンプル当たり、1X Wash Bufferを2.1 mL (10X Wash Buffer #31415 210 µL + Nuclease-free Water #12931 1.89 mL) 調製し、細胞へのストレスを最小限にするため、室温に戻してください。このWash Bufferには、スペルミジンやProtease Inhibitor Cocktail #7012を加える必要はありません。
• インプット1サンプル当たり、次の混合液を調製してください： Proteinase K #10012 2 µL + RNAse A #7013 0.5 µL + DNA Extraction Buffer #42015 197.5 µL (インプット1サンプル当たり200 µL)

1. 1.5 mLチューブ中に、検討するソニケーションの各条件に対して、CUT&RUN実験で使用するインプットと同じ数の細胞 (5,000 - 100,000細胞) を回収してください。組織については、各ソニケーション条件に対して、CUT&RUN実験で使用するインプットと同量の組織から単離した細胞を回収してください (セクションI-C、ステップ1-‭13‬) 固定した細胞や組織をCUT&RUN実験に使用する場合は、この試験でも同じ方法で細胞や組織の固定を行ってください。
2. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。

   注意：使用細胞数が少なく (100,000細胞未満) 、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、下記ステップ3 - 5の洗浄操作を省略することを推奨します。ステップ2で細胞懸濁液を最初に遠心分離した後、ペレットを崩さない程度になるべく多くの培地を除去し、培地をいくらか残すことを推奨します。この場合、ステップ6で細胞懸濁液に適量の1X Wash Bufferを加え、各ソニケーション条件当たりの合計容量を100 µLにしてください。

3. 1X Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで静かに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
4. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。
5. ステップ3と4を繰り返して、もう1度細胞ペレットを洗浄してください。
6. 各ソニケーション条件当たり、1X Wash Buffer 100 µLを加え、穏やかにピペッティングで上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
7. 細胞懸濁液100 µLを、各ソニケーションの条件ごとに新しいチューブに分注してください。

   注意：このサンプルは、ステップ9で55°Cでインキュベートします。インキュベート中の蒸発を低減させるため、セーフロックの付いた1.5 mLチューブを使用することを推奨します。

8. 各サンプルにDNA Extraction Buffer (+ Proteinase K + RNAse A) 200 µLを加えて、ピペッティングで上下させて混合してください。
9. チューブを55°Cで振盪しながら、1時間インキュベートしてください。
10. チューブを氷上に5分間置いて、サンプルを完全に冷却してください。
11. お使いのソニケーターでの最適なソニケーション条件を決定するには、15秒間のパルスソニケーションのサイクル数を増加させながら、タイムコース実験を実施してください。ソニケーション処理の合間は、サンプルを氷上に30秒間置いてください。
12. 18,500​ x gで10分間、4°Cで遠心分離して、ライセートを清澄化してください。上清を新しい2 mLチューブに移してください。
13. セクションVIに従って、DNAスピンカラム、またはフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿で、DNAサンプルを精製してください。
14. カラムからDNAを溶出するか、DNAペレットを1X TEバッファーまたはNuclease-free Water #12931 30 µLに再懸濁してください。
15. 電気泳動でDNA断片のサイズを決定してください。100 bp DNAマーカーと共に15 µL以上のサンプルを、1%アガロースゲルにロードしてください。ゲル上のDNAスメアを観察するため、色素フリーのローディングバッファー (30% グリセロール) の使用を推奨します。
16. 最適なサイズである100 - 600 bpのDNA断片が得られるソニケーション条件を選択して、セクションIII、ステップ4のインプットサンプルの調製を実施してください。最適なソニケーション条件が得られない場合は、ソニケーターの出力設定あるいはソニケーションのサイクル数を増減させて、ソニケーションのタイムコース実験を繰り返してください。

C：トラブルシューティングガイド