CUT&Tagのトラブルシューティングガイド

直面しているCUT&Tagの問題点を選択してくださいConcanavalin Aビーズが実験中に凝集する低収量、シーケンシング深度が低い、またはNG-seq解析でシグナルがないNG-seqが予測外のゲノム領域でシグナルを示す

A. 固定細胞のサンプル調製

可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aに感受性がある、あるいは敏感なタイプの細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定する下記のプロトコールを参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを大幅に増加させるわけではないことにご注意ください。過剰な固定は、CUT&Tagのシグナルを弱める可能性があります。各反応に用いる適切な細胞数を決定するには、CUT&TagプロトコールのセクションIIに記載の内容を参照してください。

注：固定細胞サンプルの調製には、本CUT&Tag Assay Kit #77552に含まれない次の試薬が必要です：37% Formaldehydeまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Glycine Solution (10X) #7005

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tagの反応数に比例させて増やす必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• Complete Wash Buffer (細胞調製1サンプルあたり2 mL、さらにCUT&Tag 1反応あたり100 µLが必要) を調製し、室温で保持します。例えば、未処理および薬剤処理した細胞の両方 (2サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体) を用いた8反応で試験する場合は、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。

Complete Wash Buffer	量 (1サンプルあたり)	量 (1反応あたり)	総量
10X Wash buffer (CUT&RUN、CUT&Tag) #31415	200 µL	10 µL	両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。
100X Spermidine #27287	20 µL	1 µL
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	10 µL	0.5 µL
Nuclease free water #12931	1770 µL	88.5 µL

1. 1反応あたり100,000個の生細胞を用意します。

注：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止してください。スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントする必要があります。

2. 細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、ホルムアルデヒドの終濃度が0.1%となるように調整してください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。
3. 固定処理した細胞懸濁液1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
4. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6か月間保存できます。

注：使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。代わりに、プロトコールを継続して下記の洗浄ステップ5-7を省略することを推奨します。ステップ4で行う最初の遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応あたり40 µL以下の培地を残す方法もあります。続くステップ8で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を1反応あたり100 µLにしてください。

5. Complete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
6. 3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。
7. ステップ5と6を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
8. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
9. 速やかにCUT&TagプロトコールのセクションIIIに進んでください。

B. 固定組織のサンプル調製

大半の組織タイプにおいて、1 mgの新鮮な組織でヒストンを十分に濃縮できます。新鮮な組織が使用できない場合は、軽く固定した組織 (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) を使用します。固定した組織サンプルは、凍結することにより使用するまで-80˚Cで6か月間まで保存できます。過剰な固定はCUT&Tagシグナルを弱める場合があります。CUT&Tagアッセイは、組織の転写因子およびコファクターの濃縮には向いていません。転写因子およびコファクターの解析には、CUT&RUN Assay Kit #86652の使用を推奨します。

注：固定組織サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です：37% Formaldehyde または 16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872、Glycine Solution (10X) #7005。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。
• 固定バッファー1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを準備してください。
• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。
• Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応あたり100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするために室温で保持してください。

Complete Wash Buffer	量 (1サンプルあたり)	量 (1反応あたり)	総量
10X Wash buffer (CUT&RUN、CUT&Tag) #31415	300 µL	10 µL	両方のカラムを足した量が、必要となる各試薬の総量です。
100X Spermidine #27287	30 µL	1 µL
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	15 µL	0.5 µL
Nuclease free water #12931	2655 µL	88.5 µL

• 細胞1サンプルあたり1 mLの固定バッファーを調製してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

固定バッファー	量 (1組織あたり)
ホルムアルデヒド	37%を2.7 µLまたは16%を6.25 µL
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	5 µL
Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872	992.3 µL

• 1組織あたりFixation Wash Bufferを1 mL調製し、氷上に置いてください。

Fixation Wash Buffer	量 (1組織あたり)
Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012	5 µL
Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872	995 µL

1. 1反応あたり新鮮な組織を1 mg測り取ってください。
2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。
3. 刻んだ組織を速やかにFixation Buffer 1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。

注：固定液1 mLで50 mgまでの組織を固定処理できます。50 mgを超える組織を処理する場合は、ステップ3のFixation Bufferとステップ7のFixation Wash Bufferを適切にスケールアップしてください。

4. 室温で2分間インキュベートしてください。
5. Fixation Buffer 1 mLあたり、10X Glycine #7005​​ 100 µLを加えてクロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。
6. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。
7. 組織をFixation Wash Buffer 1 mLに再懸濁します。
8. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して上清を除去し、ステップ9に進んでください。(​​SAFE STOP​) 固定した組織ペレットは、ホモジナイズする前に-80℃で6か月まで保存できます。
9. 組織をComplete Wash Buffer 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。
10. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。
11. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清を除去してください。
12. Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。
13. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。
14. ステップ12と13を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。
15. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。
16. 速やかにCUT&TagプロトコールのセクションIIIに進んでください。

C. 細胞のジギトニンに対する感受性の決定

CUT&Tagプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、一次抗体や二次抗体、pAG-Tn5酵素の細胞や核への進入を促進します。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の切断に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。

実験開始前の準備：

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍されて溶解していることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は、-20°Cで保管してください。
• 1反応あたり100 µLの1X Wash Bufferを調製してください。この試験では、SpermidineやProtease Inhibitor Cocktailをバッファーに加える必要はありません。

1X Wash Buffer	量 (1反応あたり)
10X Wash Buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) #31415	10 µL
Nuclease-free Water #12931	90 µL

1. 1.5 mLチューブ内に100,000個の細胞を回収し (CUT&TagプロトコールセクションII-Aのステップ1)、600 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を除去してください。組織の場合は、1 mgの組織を破砕して細胞を回収してください (CUT&TagプロトコールセクションII–B、ステップ 1 - 8)。
2. 1X Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。
3. 1反応あたり、 Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。
4. 細胞懸濁液10 µLと0.4% Trypan Blue 10 µLを混合してください。
5. 血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と総細胞数を計測してください。透過化が十分であれば、90%以上の細胞がTrypan Blueで染色されます。
6. Trypan Blueで染色された細胞数が90%未満の場合は、各反応に加えるDigitonin Solution #16359の量を増加させて、90%以上の細胞が透過化および染色されるまでステップ1-5を繰り返してください。CUT&TagプロトコールセクションI-Vでは、ここで決定した量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

D. トラブルシューティングガイド

問題	考えられる原因	推奨される対処法
1. 実験中にConcanavalin Aビーズが凝集する。	ビーズの凝集は正常で、通常はアッセイに悪影響を及ぼしません。	ピペッティングで静かに上下させて、凝集したビーズを再懸濁してください。サンプルチューブを振盪させたり回転させたりするのではなく、チューブラック上にチューブを静置することで、ビーズの凝集とチューブ壁上での乾燥を防ぐことができます。
	ビーズと細胞の室温でのインキュベート時間が長すぎます。	Concanavalin Aビーズは4°Cで活性化させて、細胞とのインキュベート時間は5分以内にしてください (CUT&TagプロトコールセクションIII、ステップ2)。
	調製中に細胞が溶解しています。	細胞のストレスを最小限にするため、生細胞は室温でできるだけすばやく調製してください (CUT&TagプロトコールセクションII)。
	ジギトニンの濃度が高すぎるのかもしれません。	一部の細胞はジギトニンに対して感受性が高く、高い濃度では溶解する場合があります。細胞の透過化に十分な量までジギトニンを減少させてください (CUT&TagプロトコールAPPENDIX Aを参照)。
2. ライブラリーの収量が低い、シーケンシング深度が低い、またはNG-seq解析でシグナルがない。	細胞が正しく計数されていないか、細胞が調製中に損失あるいは溶解しています。	使用する細胞の培養条件は60-90%コンフルエントで、健康 (生細胞が90%以上) である必要があります。自動化されたセルカウンターまたは血球計算盤を用いて、正確に細胞を計数してください。
		細胞を必要以上に長時間トリプシンで処理しないでください。ConAビーズの結合に干渉する場合があります。
		細胞のストレスを最小限にするため、細胞は室温でできるだけすばやく調製してください。
		細胞の損失を最小限にするため、最初の細胞洗浄ステップはすべて1つのチューブで実施してください (CUT&TagプロトコールセクションII)。
	細胞が過剰に固定されています。	CUT&Tagアッセイでは、可能な限り生細胞または新鮮な組織を用いることを推奨します。生細胞または新鮮な組織が利用できない場合は、0.1%ホルムアルデヒドで2分間、細胞または組織を軽く固定することを推奨します。過剰な固定はタグメンテーション反応を阻害し、シグナルの損失につながる場合があります。
	使用細胞数が少なすぎます。	可能な限り、1反応あたり100,000個の細胞を使用してください。ヒストン修飾はわずか5,000個の細胞で、転写因子やコファクターは20,000個の細胞で解析できます。しかし、良好な濃縮を得るために必要な細胞の数は、標的タンパク質の量と抗体の結合力に大きく依存します。100,000個以下の細胞を使用した際に濃縮がみられない場合は、1反応あたりの細胞数を増やしてください。可能な限り、1反応あたり100,000個の細胞を使用してください。
	開始時の細胞数が少ない場合は、Concanavalin Aビーズの結合反応の際に過剰な培地が混入しています。	Concanavalin Aビーズと結合させる際に、反応液中に40%を超える培地が存在すると、ビーズと細胞の結合が大幅に減少し、細胞が失われます。細胞懸濁液を遠心して培地を除去し、1反応あたり40 µL以下になるようにしてください。Concanavalin Aビーズとの最適な結合のために、その後Complete Wash Bufferを加えて100 µLになるようにします。
	組織サンプルが完全に破砕されていません。	組織の塊が見られなくなるまで組織サンプルを破砕し、シングルセルの懸濁液にしてください。完全に解離させることが困難な線維組織を使用する場合は、組織の破砕中における細胞の損失を補うために、開始時の使用量を増やしてください。
	ジギトニンが細胞を効果的に透過化していません。	使用前にDigitonin Solution #16359が完全に解凍されて溶解していることを確認してください。氷上で数時間保持すると、ジギトニンが溶液から析出する場合があります。
		ジギトニンの量が、使用する細胞株の透過化に十分であることを確認してください (CUT&TagプロトコールAPPENDIX Aを参照)。
		使用中はDigitonin Solution #16359を氷上で保持し、使用後は-20°Cで保管してください。Digitonin Solutionは、使用後は-20°Cで保管してください。
	pAG-Tn5酵素がアッセイで適切に機能していません。	pAG-Tn5の使用期限は6か月です。使用期限が切れたpAG-Tn5を使用しないでください。
		pAG-Tn5は活性にMg2+二価カオチンが必要です。酵素を活性化させるために、Tagmentation Bufferに適切な量の塩化マグネシウムを加えてください (CUT&TagプロトコールセクションV、ステップ12)。
		クロマチンの十分なタグメンテーションが起きるように、各CUT&Tag反応に十分な量のpAG-Tn5 (2 µL) を加え、37°Cで1時間インキュベートしてください (CUT&TagプロトコールセクションV、ステップ13)。
	抗体がCUT&Tagで機能していません。	すべての抗体 (特にヒストン以外の標的に対する抗体) がCUT&Tagで機能するわけではありません。できる限り、CUT&Tagで検証済みの抗体を使用してください。
		ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751を組み込み、アッセイ全体が機能していることを確認してください。
	ライブラリー調製中に使用したPCRサイクルが不十分です。	アッセイ開始時の1反応あたりの細胞数によりますが、13-16のPCRサイクルを用いてタグ付けされたDNAを増幅してください。CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415のプロトコールを参照してください。
3. NG-seqで予測外のゲノム領域にシグナルがみられる。	ゲノム全体にわたる非特異的なpAG-Tn5タグメンテーションが起きています。	タグメンテーション反応中に使用する10X High Salt Digitonin Bufferを希釈し過ぎないでください (CUT&TagプロトコールセクションV、ステップ12)。pAG-Tn5のオープンクロマチン領域への非特異的な結合を防ぐためには、塩濃度が高い必要があります。
		CUT&Tag検証済み抗体を使用して、pAG-Tn5を標的の遺伝子座に誘導してください。
		実験開始時に、各反応に過剰な量の細胞または組織を使用しないでください。
		ATAC-seqアッセイでみられるように、非特異的なpAG-Tn5の結合はオープンクロマチンの濃縮の増加につながります。クロマチンのオープン領域と活性化した遺伝子のプロモーターを濃縮するポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751は、ATAC-seqでの濃縮と非常によく似た結果を示します。標的に特異的な抗体を用いた濃縮とtri-methyl-Histone H3 Antibodyを用いた濃縮を比較して、非特異的なpAG-Tn5の結合およびタグメンテーションの程度を決定できます。