CUT&Tagキットプロトコール

I. Concanavalin Aビーズの活性化

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Concanavalin A Bead Activation Bufferを氷上に置いてください。

1. 実行するCUT&Tag反応の数を決めます。ポジティブコントロール、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751の反応も含めることを強く推奨します。使用するピーク抽出アルゴリズムの要件に応じて、ネガティブコントロール、Normal Rabbit IgG #2729またはNormal Mouse IgG #68860の使用も検討してください。

2. Concanavalin A磁気ビーズを、チューブからこぼれないように慎重にピペッティングで上下させて、均一な懸濁液 (粘り気あり) になるまで再懸濁してください。 

注：ボルテックスを繰り返すとConcanavalin Aがビーズから外れてしまう場合があります。Concanavalin A磁気ビーズは、プロトコールのいずれの時点でもボルテックスしないでください。

3. CUT&Tag 1反応あたりビーズ懸濁液10 µLを、新しい1.5 mLチューブに移してください。一度に14サンプルを超えるCUT&Tag反応を行う場合は、2本以上の1.5 mLチューブを使用してください。各1.5 mLチューブに140 µL以上のConcanavalin Aビーズを入れないでください。

4. ビーズ懸濁液10 µLにつきConcanavalin A Bead Activation Buffer 100 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを混合してください。

5. チューブを磁気ラックに置き (30秒間から2分間)、その後ピペットを使用して上清を除去します。 

注： ビーズの損失を避けるため、プロトコールのいずれの時点においても真空吸引はしないでください。

6. チューブを磁気ラックから外してください。ステップ4と5を繰り返して、2回目のビーズの洗浄を実施してください。

7. ビーズ懸濁液の最初の量と同量 (1反応あたり10 µL) のConcanavalin A Bead Activation Bufferを加えて、ピペッティングで上下させて再懸濁してください。 

注：活性化したビーズは氷上で最長8時間保管できます。

II. 細胞と組織のサンプルの調製

ほとんどの細胞タイプにおいて、生細胞をCUT&Tagアッセイに用いることにより、ヒストンや転写因子、コファクターを安定して濃縮できます。可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aに感受性がある、または敏感な細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定するプロトコールのAppendix Aを参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを増加させるわけではなく、過剰な固定はタグメンテーション反応にとって有害であることにご注意ください。 

また、新鮮な組織をCUT&Tagアッセイに用いることにより、ヒストンを安定して濃縮できます。ただし、組織内の転写因子やコファクターなどのヒストン以外の標的は、CUT&Tagアッセイでは十分に濃縮されません。組織内の転写因子やコファクターの解析には、CUT&RUN Assay Kit #86652の使用を推奨します。通常、新鮮な組織では、固定組織と同等またはより強力なCUT&Tagシグナルが得られます。固定が必要な場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定するプロトコールのAppendix Bを参照してください。

弊社のCUT&Tagアッセイは、様々な細胞や組織サンプルを解析できます。また、幅広いサンプル量でアッセイを開始できます。1反応あたり100,000個の細胞または1 mgの組織を使用することを推奨します。アッセイ開始時のサンプル量が限られる場合、標的がヒストン修飾であれば1反応あたりわずか5,000-10,000個の細胞、転写因子やコファクターであればわずか20,000個の細胞から始める解析も可能かもしれません。少ないインプットでの反応の成否は、標的の存在量と抗体の感度に依存します。特に転写因子とコファクターの場合、目的のCUT&Tagシグナルを得るにはアッセイ開始時のサンプル量が十分であることが不可欠です。1反応あたり、最大250,000個の細胞または5 mgの組織まで使用できます。指定された範囲内 (5,000-250,000細胞または1-5 mgの組織) であれば、全プロトコールにわたる1反応あたりのバッファーの量を、細胞数や組織の重量に応じて調節する必要はありません。指示がある場合は、実施する反応の数に応じて、比例的にバッファーの量を増やす必要があります。 

細胞の透過化に用いるジギトニンの推奨量は過剰量であり、ほとんどの細胞株や組織を十分に透過化できます。ただし、すべての細胞株や組織が、ジギトニンに対して同じ感受性を示す訳ではありません。特定の細胞株や組織で推奨濃度のジギトニンが機能しない場合は、Appendix Cのプロトコールに従って条件を最適化してください。ジギトニン処理で90%以上の細胞が透過化される必要があります。

A. 生細胞サンプルの調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• Complete Wash Buffer (細胞調製1サンプルあたり2 mL、さらにCUT&Tag 1反応あたり100 µLが必要) を調製し、室温で保持します。例えば、未処理および薬剤処理した細胞の両方 (2サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験用抗体) を用いた8反応で試験する場合、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。

注：生細胞サンプルの調製ステップは、細胞へのストレスを最小限にするため、すべて室温で連続して行う必要があります。DNAの断片化や気泡の混入を最小限にするために、ボルテックスの使用は避けてください。

1. 細胞のストレスを最小限にするため、1反応あたり100,000個の生細胞を用意します。 

注：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止させてください。スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。正確な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントする必要があります。

2. 細胞懸濁液を600 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。

注： 使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、下記のステップ3-5を省略し、すぐにステップ6を行うことを推奨します。ステップ2の細胞懸濁液の最初の遠心分離の段階で、上清の完全除去はせず、1反応あたり40 µL以下の上清を残す方法もあります。続くステップ6で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を1反応あたり100 µLにしてください。

3. 室温のComplete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

4. 600 x gで3分間、室温で遠心分離して、液体を除去してください。

5. ステップ3と4を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。

6. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

7. 速やかにセクションIIIに進んでください。

B. 組織のサンプル調製

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応あたり100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするため室温で保持してください。例えば、野生型および遺伝子導入した肝臓サンプル (2種類の組織) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2種類の実験抗体) を用いて8反応で試験する場合、合計6.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。

1. 新鮮な組織を、1反応あたり1 mg測り取ります。 

2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。

3. 組織をComplete Wash Buffer 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。 

4. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。

5. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清をピペットで除去してください。

6. Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。

7. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。

8. ステップ6と7を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。

9. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

10. 速やかにセクションIIIに進んでください。

III. Concanavalin Aビーズと一次抗体の結合

注：セクションIII-Vのすべてのインキュベーションステップにおいて、振盪または回転によってサンプルを攪拌させる必要はなく、指定の温度でチューブラック上に静置することを推奨します。インキュベーションステップ中にサンプルを攪拌することでアッセイの性能が向上することはなく、サンプルを回転させたり振盪させたりすると、ビーズがチューブ壁やキャップに付着し、凝集や損失につながる可能性があります。

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• 1反応あたりComplete Antibody Binding Buffer 100 µLを加えて、氷上に置いてください。

1. セクションIのステップ7で調製済みの活性化したConcanavalin Aビーズを、ピペッティングで穏やかに上下させて攪拌してください。セクションII-Aステップ6またはセクションII-Bステップ9で調製および洗浄した細胞懸濁液に、ビーズ懸濁液を加えてください。

2. サンプルを室温で5分間インキュベートしてください。

3. チューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。

4. チューブを磁気から外してください。1反応あたり100 µLのComplete Antibody Binding Bufferを加えて、ピペッティングで穏やかに攪拌してください。

5. 細胞とビーズの懸濁液100 µLを1反応分として、別々の1.5 mLチューブに分注して氷上に置いてください。

6. 各チューブに適量の一次抗体を加えて、ピペッティングで上下させて穏やかに混合してください。

注：CUT&Tag反応に必要な抗体の量は異なりますので、それぞれに決定する必要があります。ポジティブコントロールのTri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751、もしくはネガティブコントロールのRabbit IgG #2729またはNormal Mouse IgG #68860の場合は、1反応あたり2 µLの抗体を加えてください。可能な限り、アッセイにCUT&Tag検証済み抗体を使用することを強く推奨します。CSTは、サポートデータの閲覧が可能な、適切な希釈率を決定済みの様々なCUT&Tag検証済み抗体を提供しています。

7. サンプルを室温で1時間インキュベートしてください。このステップは4°Cで一晩まで延長できます。 

8. 速やかにセクションIVに進んでください。

IV. 二次抗体の結合

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• 1反応あたり1.05 mLのDigitonin Bufferを新たに調製して氷上に置いてください。  

注意：ここで調製したDigitonin BufferをセクションIVとVの両方で使用します。

1. 二次抗体のプレミックスを作ります。1反応あたりGoat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody #35401 1 µL、またはDonkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody #52885 1 µLを50 µLのDigitonin Bufferで希釈します。反応の数に応じて、二次抗体プレミックスを比例的に増やしてください。穏やかにピペッティングで上下させて攪拌し、氷上に置いてください。

2. セクションIIIステップ7の、一次抗体の入ったサンプルチューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。

3. 各サンプルチューブに二次抗体プレミックス50 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてサンプルを混合してください。

4. サンプルを室温で30分間インキュベートしてください。 

5. 速やかにセクションVに進んでください。

V. pAG-Tn5酵素の結合とタグメンテーション

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 10% SDS Solution #20533が完全に溶解していることを確認してください。37°Cに温めることでSDSの沈殿が溶解しやすくなります。

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• 1反応あたりHigh Salt Digitonin Buffer 1.2 mLを加えて、氷上に置いてください。

• 1反応あたりTagmentation Buffer 150 µLを加えて、氷上に置いてください。

1. 1反応あたり、CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 2 µLをHigh Salt Digitonin Buffer 50 µLで希釈して、pAG-Tn5プレミックスを調製してください。反応の数に応じて、pAG-Tn5プレミックスを比例的に増やしてください。ピペッティングで上下させて穏やかに混合し、氷上に置いてください。

2. セクションIVステップ4の、二次抗体をインキュベーションした溶液の入ったサンプルチューブを磁気ラックに30秒間から2分間置き、その後上清を除去してください。

3. チューブを磁気ラックから外してください。セクションIVで調製したジギトニンバッファー500 µLを加えてください。ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。

4. チューブを30秒間から2分間磁気ラックに置き、その後上清を除去してください。

5. ステップ3と4をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。

6. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにpAG-Tn5プレミックス50 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてサンプルを混合してください。

7. 室温で1時間インキュベートしてください。

8. チューブを30秒間から2分間Magnetic Separation Rackに置き、その後上清を除去してください。

9. チューブを磁気分離ラックから外してください。High Salt Digitonin Buffer 500 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させてビーズを再懸濁してください。

10. チューブを30秒間から2分間磁気ラックに置き、その後上清を除去してください。

11. ステップ9と10をもう1度繰り返し、2度目の洗浄を実施してください。

12. チューブを磁気ラックから外してください。各チューブにTagmentation Buffer 150 µLを加えて、ピペッティングで上下させて混合してください。

13. サンプルを37°Cで1時間、インキュベートしてください。

14. タグメンテーションを停止するには、各サンプルに0.5 M EDTA #7011 6.75 µL、10% SDS #20533 8.25 µL、20 mg/mL Proteinase K #10012 1.5 µLを加え、軽くボルテックスして攪拌してください。

15. サンプルを58°Cで1時間インキュベートして、タグ付けされたクロマチン断片を溶液中に放出させてください。インキュベーションは一晩まで延長することができます。一晩インキュベートする場合は、サンプルの蒸発を防ぐためにセーフロックチューブを使用してください。

注：固定細胞または組織サンプルの場合、十分に脱クロスリンクするために65°Cで2時間、サンプルをセーフロックチューブでインキュベートしてください。このインキュベーションは一晩行えます。

16. チューブを16,000 x gで2分間、室温で遠心分離し、2秒間から30分間磁気ラックに置いてください。

17. 上清を新しい1.5 mLチューブに移してください。これが、精製前のCUT&Tag DNAサンプルです。

18. セクションVIに進んでください。(SAFE STOP) サンプルを-20℃で保存できます (最長1週間)。ただし、DNAの精製 (セクションVI) に移る前に、サンプルを必ず室温まで温めてください。

VI. DNAの精製

実験開始前の準備：

• DNA Purification Columns、DNA Binding Buffer、DNA Wash Buffer、DNA Elution Bufferを、使用前に室温に平衡化してください。

• !! 使用前に、DNA Wash Bufferにエタノール (96-100%) 24 mLを加えてください。本ステップは、DNA精製の最初のセッティング前に1度だけ実施してください。

• 精製するCUT&Tag DNA 1サンプルあり、DNA Purification Collection Tube1個を使用してください。

1. 各CUT&Tag DNAサンプルにDNA Binding Buffer 833 µLを加え、ピペッティングで上下させて混合してください。

注：1サンプルあたり5倍量のDNA Binding Bufferを使用します。

2. ステップ1のサンプル600 μLを、コレクションチューブにセットしたDNAスピンカラムに移してください。

3. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。

4. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。

5. ステップ2-4を繰り返し、ステップ1のサンプル (1.5 mL) をすべてカラムにロードしてください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。

6. DNA Wash Buffer 750 μLを、コレクションチューブにセットしたスピンカラムに加えてください。

7. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。

8. コレクションチューブからスピンカラムを取り外し、液体を廃棄してください。空になったコレクションチューブにスピンカラムを再セットしてください。

9. 18,500​ x gで30秒間遠心分離してください。

10. コレクションチューブと液体を廃棄してください。スピンカラムは廃棄しないでください。

11. スピンカラムにDNA Elution Buffer 30 μLを加え、新しい1.5 mLチューブにセットしてください。 

注：カラムからDNAを完全に溶出するには、最低30 µLのDNA Elution Bufferが必要です。

12. 18,500​ x gで30秒間遠心分離して、DNAを溶出してください。

13. DNAスピンカラムを取り外し、廃棄してください。得られた溶出液が精製されたDNAです。(SAFE STOP) サンプルは-20℃で最長6か月間保存可能です。

注：CUT&Tag DNAの収量は一般的に低いことを考慮し、ライブラリー増幅にDNAサンプル30 µLをすべて使用することを強く推奨します。

VII. NG-seqライブラリーの調製

本キットを用いて調製したDNAサンプルは、直接NG-seqに使用できます。NG-seq用のDNAライブラリーの調製には、下流のシーケンシングプラットフォームに対応するプロトコールやキットを使用してください。Illumina Systemsプラットフォームでのシーケンシングの場合、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415の使用を推奨します。DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795、およびMultiplex Oligos for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580または#47538は、CUT&Tag DNAサンプルに適していません。

DNAライブラリーの調製に関するその他の推奨事項：

• 増幅されたCUT&Tag DNAライブラリーの収量は、用いるDNA定量の手法によって異なります。NanoDropまたはQIAxpert Systemを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば10-20 ng/µL、ヒストン以外であれば5-12 ng/µLです。NanoDropまたはQIAxpert Systemでのライブラリー濃度が3 ng/µL以下である場合は、サンプルをシーケンシングする前にトラブルシューティングガイドを参照してください。Qubit Fluorometric Quantification systemまたはPicogreenアッセイを使用する場合、予想されるライブラリー濃度は、標的がヒストンであれば3-10 ng/µL、ヒストン以外であれば1 ng/µL以下です。低濃度のため、BioanalyzerまたはTapeStationシステムでは、特に細胞内の存在量が低い標的の場合に、ピークが非常に弱いまたはピークがみられないプロファイルを示す可能性があります。そのような場合でも、Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751などのポジティブコントロールで期待通りのライブラリーの収量が得られる、またはBioanalyzerでピークが得られる、またはその両方であれば実験は成功しているため、NGSでの解析に進むことを推奨します。CUT&Tagのよくある質問のページを参照して、サポートデータや、収量が異なるサンプルを混合する際の注意事項をご覧ください。

• 標的の種類に関わらず、シーケンシング深度は通常1サンプルあたり200万リードで十分です。シーケンシング深度が1サンプルあたり1,500万以上の場合、リードの重複率が大幅に上昇します。シーケンシング深度が1サンプルあたり100万未満の場合は、S/N比が低下します。

• 使用した細胞数が20,000個未満の場合は、一般的にNGSで得られるリードのマッピング率が低下するか、重複率が上昇します。このような場合、下流のデータ解析に十分な量のマッピングされた個々のリードを得るために、シーケンシング深度を上げることを推奨します。 

参考：固定細胞のサンプル調製

可能な限り生細胞を用いることを強く推奨します。Concanavalin Aに感受性がある、あるいは敏感なタイプの細胞の場合は、CUT&Tag実験前に細胞を軽く固定する下記のプロトコールを参照してください。細胞の固定は、CUT&Tagシグナルを大幅に増加させるわけではないことにご注意ください。過剰な固定は、CUT&Tagのシグナルを弱める可能性があります。各反応に用いる適切な細胞数を決定するには、セクションIIに記載の内容を参照してください。 

注：固定細胞サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です：37% Formaldehydeまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Glycine Solution (10X) #7005

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• Complete Wash Buffer (細胞調製1サンプルあたり2 mL、さらにCUT&Tag 1反応あたり100 µLが必要) を調製し、室温で保持します。例えば、未処理および薬剤処理した細胞 (2サンプルの細胞調製) と、4種類の抗体 (ポジティブコントロールのH3K4me3 #9751、ネガティブコントロールのIgG #2729または#68860、および2つの実験抗体) を用いて8反応で試験する場合、合計4.8 mLのComplete Wash Bufferが必要です。

1. 1反応あたり100,000個の生細胞を用意します。 

注：接着細胞を回収する場合は、トリプシン処理で細胞を培養皿から剥離させた後、3倍量以上の組織培養液で反応を停止してください。スクレイパーを用いて培養皿から細胞を掻き取ると細胞を溶解させてしまう場合もあるため、CSTはこれを推奨しません。適切な数の細胞を実験に用いるため、血球計算盤やその他の細胞計数装置で細胞数を正確にカウントする必要があります。

2. 細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL加え、ホルムアルデヒドの終濃度が0.1%となるように調整してください。チューブを転倒混和しながら室温で2分間インキュベートしてください。

3. 固定処理した細胞懸濁液1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。

4. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。速やかにステップ5に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6か月間保存できます。

注：使用細胞数が少なく (100,000個未満)、遠心分離で集めた細胞ペレットが肉眼で確認できない場合は、細胞ペレットの凍結保存を推奨しません。代わりに、プロトコールを継続して下記の洗浄ステップ5-7を省略することを推奨します。ステップ4で行う最初の遠心分離の段階で上清の完全除去はせず、1反応あたり40 µL以下の培地を残す方法もあります。続くステップ8で、適量のComplete Wash Bufferを加え、細胞懸濁液の総量を1反応あたり100 µLにしてください。

5. Complete Wash Buffer 1 mLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

6. 3,000 x gで3分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。

7. ステップ5と6を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。 

8. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

9. 速やかにセクションIIIに進んでください。

APPENDIX B：固定組織のサンプル調製

大半の組織タイプにおいて、1 mgの新鮮な組織でヒストンを十分に濃縮できます。新鮮な組織が使用できない場合は、軽く固定した組織 (0.1%ホルムアルデヒドで2分間) を使用します。固定した組織サンプルは、凍結することにより使用するまで-80˚Cで6か月間まで保存できます。CUT&Tagアッセイは、組織の転写因子およびコファクターの濃縮には向いていません。転写因子およびコファクターの解析には、CUT&RUN Assay Kit #86652の使用を推奨します。

注：固定組織サンプルの調製には、本キットに含まれない次の試薬が必要です：37%ホルムアルデヒドまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606、Phosphate Buffered Saline (PBS) #9872、およびGlycine Solution (10X) #7005

実験開始前の準備：

! すべてのバッファーの量は、実施するCUT&Tag反応の数に応じて比例的に増加させる必要があります。

• 固定処理を行う細胞懸濁液1 mLあたり、37% Formaldehydeを2.7 µLまたは16% Formaldehyde Methanol-Free #12606を6.25 µL取り分け、室温で保持してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

• 固定バッファー1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005 100 µLを準備してください。

• 使用前に200X Protease Inhibitor Cocktail #7012および100X Spermidine #27287を完全に解凍し、使用後は-20°Cで保管してください。Protease Inhibitor Cocktail #7012はDMSO含有のため、氷上に置くと再度凍結することにご注意ください。

• Complete Wash Buffer (組織調製1サンプルあたり3 mL、さらに1反応あたり100 µLが必要) を調製し、細胞のストレスを最小限にするために室温で保持してください。 

• 細胞1サンプルあたり1 mLの固定バッファーを調製してください。使用期限内の新しいホルムアルデヒドを使用してください。

• 1組織あたりFixation Wash Bufferを1 mL調製し、氷上に置いてください。

1. 1反応あたり新鮮な組織を1 mg測り取ってください。 

2. 組織サンプルをシャーレに置き、清潔な解剖用メスまたは剃刀の刃で細かく切り刻んでください。シャーレは氷上に置いてください。タンパク質分解を防ぐため、組織をよく冷やす必要があります。

3. 刻んだ組織を速やかにFixation Buffer 1 mLに移し、チューブを転倒混和してください。  

注：この容量の固定液で50 mgまでの組織を固定処理できます。50 mgを超える組織を処理する場合は、ステップ3のFixation Bufferとステップ7のFixation Wash Bufferを適切にスケールアップをしてください。

4. 室温で2分間インキュベートしてください。

5. Fixation Buffer1 mLあたり、Glycine Solution (10X) #7005を100 µL加え、クロスリンクを停止してください。チューブを転倒混和しながら室温で5分間インキュベートしてください。

6. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して、上清を除去してください。

7. 組織をFixation Wash Buffer 1 mLに再懸濁します。

8. 2,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離して上清を除去し、ステップ9に進んでください。(SAFE STOP) 固定した細胞ペレットは、使用するまで-80°Cで6か月間保存できます。

9. 組織をComplete Wash Buffer 1 mLに再懸濁し、サンプルをダウンスホモジナイザーに移してください。 

10. 組織片を、シングルセル懸濁液になるまで破砕してください。20-25ストロークで、組織の塊が見られなくなるまでホモジナイズしてください。

11. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、細胞から上清を除去してください。

12. Complete Wash Buffer 1 mLで細胞ペレットを再懸濁してください。

13. 細胞懸濁液を3,000 x gで3分間、室温で遠心分離して、上清を除去してください。

14. ステップ12と13を繰り返して、2度目の細胞ペレットの洗浄を実施してください。

15. 1反応あたりComplete Wash Buffer 100 µLを加えて、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞ペレットを再懸濁してください。

16. 速やかにセクションIIIに進んでください。

APPENDIX C：細胞のジギトニンに対する感受性の決定

CUT&Tagプロトコールでは、ジギトニンをバッファーに添加することで細胞膜を透過化し、一次抗体や二次抗体、pAG-Tn5酵素の細胞や核への進入を促進します。このため、バッファーが適量のジギトニンを含むことは、抗体と酵素の結合および標的ゲノム遺伝子座の切断に不可欠です。異なる細胞株は、ジギトニンの細胞透過化に対して異なる感受性を示します。本プロトコールで推奨されているジギトニンの量は、ほとんどの細胞株や組織の透過化に十分ですが、下記のプロトコールを用いて、使用する特定の細胞株や組織のジギトニン感受性試験を行うことができます。過剰なジギトニンの添加はアッセイに対して有害ではないことが分かっていますので、濃度曲線を作成する必要はありません。推奨されるジギトニンの量が使用する細胞株に十分かどうかを、簡単な試験により判断します。

実験開始前の準備：

• Digitonin Solution #16359を90-100°Cで5分間温め、完全に解凍および溶解されていることを確認してください。解凍したDigitonin Solution #16359はすぐに氷上に置き、使用中は氷上で保持してください。使用後は-20°Cで保管してください。

• 1反応あたり100 µLの1X Wash Bufferを調製してください。この試験では、SpermidineやProtease Inhibitor Cocktailをバッファーに加える必要はありません。

1. 1.5 mLチューブ内に100,000個の細胞を回収し (セクションII-Aのステップ1)、600 x gで3分間、室温で遠心分離し、上清を除去してください。組織の場合は、1 mgの組織から解離した細胞を回収してください (セクションII-B、ステップ1-8)。 

2. 1X Wash Buffer 100 µLに細胞ペレットを再懸濁してください。

3. 1反応あたり、Digitonin Solution #16359を2.5 µL加え、室温で10分間インキュベートしてください。

4. 細胞懸濁液10 µLと0.4% Trypan Blue 10 µLを混合してください。

5. 血球計算盤またはセルカウンターを使用して、染色された細胞数と総細胞数を計測してください。透過化が十分であれば、90%以上の細胞がTrypan Blueで染色されます。

6. Trypan Blueで染色された細胞数が90%未満の場合は、各反応に加えるDigitonin Solution #16359の量を増加させて、90%以上の細胞が透過化および染色されるまでステップ1-5を繰り返してください。セクションI-IVでは、ここで決定した量のDigitonin Solution #16359を使用してください。

APPENDIX D：トラブルシューティングガイド