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免疫蛍光染色 (IF) のトラブルシューティングガイド

シグナルが弱いあるいは検出されない

考えられる原因

推奨される対処法

サンプルの保管が不適切。蛍光色素が長時間光にさらされると、シグナルが減衰することがある

サンプルのインキュベートと保存は、暗所で行ってください。ProLong® Gold Antifade Reagent #9071などの褪色防止剤でサンプルを封入することを推奨します。サンプルは封入後、すぐに観察してください。

細胞/組織サンプルの保存期間が長すぎる

抗原性の低下を防ぐため、作成してすぐのスライド/プレートを使用してください。

固定が不適切

推奨プロトコールを製品のデータシートで確認してください。薬剤などで処理した後は、培地を除去し、固定液中で素早くかつ十分に固定してください。リン酸化特異的抗体については、4%以上のホルムアルデヒドを用いて内因性ホスファターゼの活性を阻害してください。

希釈率が不適切 (抗体濃度が低すぎる)

推奨希釈率を製品データシートあるいは製品ウェブページで確認してください。

推奨されたインキュベート時間を用いていない

一次抗体のインキュベートについて十分に検証されたプロトコールを用いることで、一貫性と信頼性のある結果が得られます。CSTの抗体は、4°Cで一晩インキュベートすることで最良の結果が得られるように開発され、検証されています。

試験モデルが不適切

可能なら、ウェスタンブロッティングやその他の手法によって標的タンパク質の発現を確認してください。

標的タンパク質の発現が適切に誘導されていない

標的タンパク質ごとに、最適な処理条件とコントロールを決定してください。

標的タンパク質の発現量が低い

検出方法を変更してください。シグナルの増幅、あるいは、より明るい蛍光色素の組み合わせを検討してください。

透過化の方法が不適切

推奨プロトコールを製品データシートで確認してください。

二次抗体の使用が不適切

推奨希釈率で使用し、また、二次抗体が一次抗体の宿主種と一致することを確認してください。

励起波長が不適切

光源と検出方法 (レーザー/励起/吸収フィルター) が、蛍光色素の励起波長と一致することを確認してください。

マルチプレックス免疫組織化学染色でシグナルが低い

脱パラフィン、抗原賦活化、シグナル増幅の方法を最適化してください。

バックグラウンドが高い

考えられる原因

推奨される対処法

サンプルの自家蛍光

染色していないサンプルをコントロールとして用いて、自家蛍光のレベルを確認してください。推奨された固定液を製品データシートで確認してください。古くなった固定液では自家蛍光が高くなる可能性があります。ホルムアルデヒド溶液が古い場合は、新たに調製してください。アンプルから新たに希釈したEMグレードのグルタルアルデヒドを使用してください。発現量の低い標的に対しては、波長のより長いチャネルを選択してください。

ブロッキングが不適切

用いる二次抗体と同じ動物種の正常な血清を使用してください。バックグラウンドの原因によっては、Image-iT® FX Signal Enhancer #11932など、電荷に基づいたブロッキング剤の使用を検討してください。

抗体の希釈率が不適切 (一次抗体あるいは二次抗体の濃度が高すぎる)

推奨希釈率を製品データシートあるいは製品ウェブページで確認してください。

サンプルの乾燥

染色処理の間、サンプルが常に液体で覆われていることが重要です。

洗浄が不十分

洗浄によって、過剰な固定液、過剰な二次抗体、弱く非特異的に結合している抗体を取り除いてください。

二次抗体の交差反応

アイソタイプコントロール抗体を使用して、二次抗体が交差反応しているかどうかを確認してください。

非特異的な抗体結合

可能なら、ノックダウン (siRNA) あるいはノックアウト細胞と比較するか、標的となる抗原の発現が高いあるいは低いことが知られている細胞と比較してください。

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