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13593
Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol)
バッファー & 蛍光色素
Buffer Kit

Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593

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13593S
1 Kit  (100 tests)

Reagents Not Included

  1. Red blood cell lysis buffer
  2. Unconjugated or conjugated primary antibody
  3. Fluorochrome-conjugated secondary antibody (if applicable)
  4. Cellular dyes (e.g., live-dead discrimination, DNA dyes, etc.), optional

NOTE: When using any primary or secondary antibody for the first time, titrate the antibody to determine which dilution allows for the strongest specific signal with the least background for your sample.

保存

All components in this kit are stable for at least 12 months when stored at the recommended temperature and left unused. Formaldehyde fixative should be used within one month after opening. Upon receipt, #13616 should be stored at 4°C. Remaining components should be stored at room temperature.

プロトコール

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#13593 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol)

NOTE: Prior to using this kit, refer to the product webpage for antibodies of interest to determine whether they are validated for Flow Cytometry (F) assays using a methanol permeabilization protocol.

NOTE: When used in conjunction with fluorescent cellular dyes (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for recommended protocol. Visit www.cellsignal.com/flowdyes for a listing of flow cytometry validated cellular dyes.

A. 溶液および試薬

Supplied Reagents:

  1. 10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline (PBS) (#12528): Dilute desired amount to a 1X working solution with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water, mix. 4℃で保存し、希釈した後は1ヵ月以内に使い切ってください。
  2. 4% Formaldehyde, methanol-free (#47746): Store at room temperature. Use within one month once opened.
  3. 100% Methanol (#13604): Keep at room temperature for long-term storage. Chill to -20°C before use.
  4. Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616): Store at 4°C.

Additional Reagents (Not Supplied):

  1. Red blood cell lysis buffer (#46232)
  2. Unconjugated or fluorochrome-conjugated primary antibodies
  3. Fluorochrome-conjugated secondary antibodies (if applicable)
  4. Cellular dyes (e.g., live-dead discrimination, DNA dyes, etc.), optional

B. 固定

注意:接着細胞や組織は固定操作の前に十分に解離させ、単一細胞の懸濁液にする必要があります。

注意:CDマーカーやその他細胞外タンパク質を標的とする抗体について、エピトープがホルムアルデヒドやメタノールで破壊される場合は、抗体反応を固定操作の前に行うことがあります。この場合、抗体が標的に結合したままの状態で固定と透過化プロセスを行います。ただし、一部の蛍光色素 (PEやAPC) はメタノールで損傷を受けますので、透過化の前に加えないでください。初めて行う実験については、スモールスケールで予備実験を行うことをお勧めします。

  1. 遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去してください。
  2. 100万細胞当たり100 µLの4%ホルムアルデヒドを加え、再懸濁してください。個々の細胞どうしがクロスリンクされないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25℃) で15分間固定してください。
  4. 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。透過化の手順に進んでください。
    1. Alternatively, cells may be stored overnight at 4ºC in 1X PBS.

C. 透過化処理

  1. Permeabilize cells by adding ice-cold 100% Methanol slowly to pre-chilled cells, while gently vortexing, to a final concentration of 90% methanol.
  2. 氷上に最低10分間静置し、透過化してください。
  3. Proceed with Immunostaining or store cells at -20°C in 90% Methanol.

D. 免疫染色

注意​:血球計算盤または代替の方法により細胞数を測定してください。

  1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x105-1x106細胞が必要です。)
  2. 過剰量の1X PBSで細胞を洗浄し、メタノールを除いてください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. Resuspend cells in 100 µl of diluted antibody or antibody conjugates, prepared in Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) at the recommended dilutions. 推奨希釈率は、個々の抗体のデータシートあるいはウェブの製品ページを参照するか、タイトレーションを行って決定してください。
  4. Incubate for 1 hr at room temperature (20-25ºC).
  5. Wash by centrifugation in excess 1X Wash Buffer. 上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  6. If using fluorochrome-conjugated primary antibodies, resuspend cells in 200-500 µl 1X Wash Buffer and analyze on flow cytometer. For unconjugated primary antibodies, proceed to next step.
  7. Resuspend cells in fluorochrome-conjugated secondary antibody, diluted in Flow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) at the recommended dilution.
  8. Incubate for 30 min at room temperature (20-25ºC).
  9. Wash by centrifugation in excess 1X Wash Buffer. 上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  10. Resuspend cells in 200-500 µl 1X Wash Buffer and analyze on flow cytometer.

更新:2018年8月

改訂日:2019年10月

Protocol Id: 1728

Product Description

The Intracellular Flow Cytometry Kit provides the supporting reagents needed to preserve protein states and enable antibodies to bind intracellular targets, for flow cytometric analysis of cells in suspension. This kit contains sufficient reagents for 100 individual samples when following the included protocol.

IMPORTANT: Please refer to the antibody product page to determine if it is validated for use in Flow Cytometry (F) and for information regarding appropriate antibody dilution. Some primary antibodies may require detergent permeabilization, which will be noted on the datasheet. Detergent is not included in this kit.

研究用のみ。診断手順では使用しません。

Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.

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