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CAR (Whitlow/218 Linker) Antigen Density Quantitation Kit (PE) #33709

    Product Information

    Protocol

    Product Description

    The CAR (Whitlow/218 Linker) Antigen Density Quantitation Kit (PE) enables the quantitative analysis of chimeric antigen receptor (CAR) surface expression on cells that are engineered to express a Whitlow/218 linker-containing single-chain variable fragment (scFv)-based CAR. The kit contains bead populations surface labeled with increasing amounts of phycoerythrin (PE) calibrated in molecules of equivalent soluble fluorochrome (MESF) units. Analyzing the beads on a flow cytometer enables the generation of a calibration curve that relates instrument geometric mean or median fluorescence intensity (MFI) to standardized MESF units. Because the beads are surface labeled with the actual fluorochrome conjugated to the antibodies used to stain cells, the standards are environmentally responsive (e.g., to pH, temperature, etc.). Quantitative assignments are truly relevant when run on the same day, at the same instrument settings (e.g., PMT voltages, compensation), and in the same buffer formulation as the cell samples. The PE-conjugated antibody included in this kit was purified to have an average degree of label (DOL) of approximately 1.0.

    Assuming monovalent antibody-to-CAR binding, the MESF values after subtracting background will equate to the number of CAR molecules on the cell surface.

    This Cell Signaling Technology® antibody is conjugated to PE under optimal conditions and tested in-house for direct flow cytometric analysis in human cells. This antibody conjugate is expected to exhibit the same reactivity as the unconjugated Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb #57710, which is expected to react with cell surface expressed CARs of varying specificity containing a Whitlow/218 linker within the scFv of the extracellular domain.

    Bead Specifications

    Calibration beads are polystyrene microspheres with a mean diameter of 6-9 μm, unlabeled or labeled with increasing amounts of PE calibrated in MESF units. The beads are supplied in dropper bottles at a concentration of approximately 2 x 106 beads/mL.

    Specificity / Sensitivity

    Whitlow/218 Linker (E3U7Q) Rabbit mAb (PE Conjugate) recognizes exogenously expressed levels of scFv-based CARs containing a Whitlow/218 linker.

    Species Reactivity:

    All Species Expected

    Background

    The stoichiometric relationship between surface expressed scFv-based chimeric antigen receptors (CARs) and their cognate antigens expressed on target cells is a critical determinant of the efficacy of CAR-engineered immune cells. As such, accurate measurement of CAR density on the cell surface is of paramount importance to assess how changes to CAR structure and cell engineering protocols affect CAR expression (1-15).

    The Whitlow/218 peptide is a commonly used linker that connects the variable heavy (VH) domain and variable light (VL) domain of single-chain variable fragments (scFvs) and CARs that utilize an extracellular domain scFv for target antigen recognition. The Whitlow/218 linker affords the scFv with enhanced resistance to proteolysis and aggregation (16).
    1. Gratama, J.W. et al. (1997) Cytometry 30, 10-22.
    2. Kay, S. et al. (2006) Cytometry B Clin Cytom 70, 218-26.
    3. Schwartz, A. et al. (1996) Cytometry 26, 22-31.
    4. Iannone, M.A. et al. (2003) Methods Mol Biol 226, 123-34.
    5. Mizutani, K. et al. (2007) Am J Transplant 7, 1027-31.
    6. Baerlocher, G.M. et al. (2006) Nat Protoc 1, 2365-76.
    7. Wood, J.C. and Hoffman, R.A. (1998) Cytometry 33, 256-9.
    8. Chan, K.W. et al. (2004) Anal Biochem 334, 227-33.
    9. Vaidya, S. (2008) Transplantation 85, 1046-50.
    10. Schwartz, A. and Fernández-Repollet, E. (1993) Ann N Y Acad Sci 677, 28-39.
    11. Zagursky, R.J. et al. (1995) Biotechniques 18, 504-9.
    12. Lenkei, R. and Andersson, B. (1995) J Immunol Methods 183, 267-77.
    13. Denny, T.N. et al. (1996) Cytometry 26, 265-74.
    14. Borowitz, M.J. et al. (1997) Blood 89, 3960-6.
    15. Schwartz, A. et al. (1998) Cytometry 33, 106-14.
    16. Whitlow, M. et al. (1993) Protein Eng 6, 989-95.

    使用に関する制限

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    研究専用 (For Research Use Only) またはこれに類似する表示がされた製品は、 いかなる目的についても FDA または外国もしくは国内のその他の規制機関により承認、認可または許可を受けていません。 お客様は製品を診断もしくは治療目的で使用してはならず、また、製品に表示された内容に違反する方法で使用してはなりません。 CST が販売または使用許諾する製品は、エンドユーザーであるお客様に対し、使途を研究および開発のみに限定して提供されるものです。 診断、予防もしくは治療目的で製品を使用することまたは製品を再販売 (単独であるか他の製品等の一部であるかを問いません) もしくはその他の商業的利用の目的で購入することについては、CST から別途許諾を得る必要があります。 お客様は以下の事項を遵守しなければなりません。(a) CST の製品 (単独であるか他の資材と一緒であるかを問いません) を販売、使用許諾、貸与、寄付もしくはその他の態様で第三者に譲渡したり使用させたりしてはなりません。また、商用の製品を製造するために CST の製品を使用してはなりません。(b) 複製、改変、リバースエンジニアリング、逆コンパイル、 分解または他の方法により製品の構造または技術を解明しようとしてはなりません。また、 CST の製品またはサービスと競合する製品またはサービスを開発する目的で CST の製品を使用してはなりません。(c) CST の製品の商標、商号、ロゴ、特許または著作権に関する通知または表示を除去したり改変したりしてはなりません。(d) CST の製品をCST 製品販売条件(CST’s Product Terms of Sale) および該当する書面のみに従って使用しなければなりません。(e) CST の製品に関連してお客様が使用する第三者の製品またはサービスに関する使用許諾条件、 サービス提供条件またはこれに類する合意事項を遵守しなければなりません。

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