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9272
Akt Antibody
一次抗体
Polyclonal Antibody

Akt Antibody #9272

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Filter:
  1. WB
  2. IP
  3. IF
  4. F

Western blot analysis of extracts from CHO cells, transfected with non-targeted (-) or SignalSilence® Akt siRNA I (+) siRNA, using Akt Antibody #9272 and p42 MAP Kinase (Erk2) Antibody #9108. The Akt antibody confirms silencing of protein expression while the p42 MAP Kinase (Erk2) antibody was used to control for loading and specificity of Akt siRNA (A). Phospho-GSK-3β (Ser9) Antibody #9336 was used to confirm downstream pathway inhibition (B).

Western blot analysis of extracts from HeLa cells, transfected with 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Fluorescein Conjugate) #6201 (-) or SignalSilence® Akt siRNA I (+), using Akt Antibody #9272 and p42 MAP Kinase (Erk2) Antibody #9108. Akt antibody confirms silencing of Akt expression, while the p42 MAP kinase (Erk2) antibody is used to control for loading and specificity of Akt siRNA.

Western blot analysis of extracts from NIH/3T3 cells, untreated or PDGF-treated (50 ng/ml) for the indicated times, using Phospho-Akt (Ser473) Antibody #9271 (upper) or Akt Antibody (lower).

Confocal immunofluorescent images of C2C12 cells showing nuclear and cytoplasmic localization with Akt Antibody (left, red) compared to an isotype control (right). Actin filaments have been labeled with fluorescein phalloidin.

Flow cytometric analysis of Jurkat cells, untreated (blue) or LY294002-treated (green), using Akt Antibody compared to a nonspecific negative control antibody (red).

To Purchase # 9272S
製品番号 サイズ 価格 在庫
9272S
100 µl

Supporting Data

REACTIVITY H M R Hm Mk C Dm B Dg Pg GP
SENSITIVITY Endogenous
MW (kDa) 60
SOURCE ラビット

Application Key:

  • W-Western
  • IP-Immunoprecipitation
  • IHC-Immunohistochemistry
  • ChIP-Chromatin Immunoprecipitation
  • IF-Immunofluorescence
  • F-Flow Cytometry
  • E-P-ELISA-Peptide

Species Cross-Reactivity Key:

  • H-Human
  • M-Mouse
  • R-Rat
  • Hm-Hamster
  • Mk-Monkey
  • Mi-Mink
  • C-Chicken
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovine
  • Dg-Dog
  • Pg-Pig
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • Hr-Horse
  • All-All Species Expected

製品概要

アプリケーション 希釈率
ウェスタンブロッティング 1:1000
免疫沈降 1:50
免疫蛍光染色 (免疫細胞染色) 1:200
フローサイトメトリー 1:50

保存

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA and 50% glycerol. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

プロトコール

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ウェスタンブロッティング (WB) プロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAおよび0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用してください。

注意:抗体の推奨希釈率については、各製品のデータシートまたはウェブの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

サンプル調製から検出まで、ウェスタンブロットに必要な全ての試薬が一つの便利なキット、Western Blotting Application Solutions Kit #12957になりました。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808):1X PBSを1 L調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS) (#12498):1X TBSを1 L調製する場合は、10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDSサンプルバッファー (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに、1/10量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X Tris-Glycine SDS Running Buffer (#4050):1X Running Bufferを1 L調製する場合、10X Running Buffer 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  5. 10X Tris-Glycine Transfer Buffer (#12539):1X Transfer Bufferを1 L調製する場合、10X Transfer Buffer 100 mLをメタノール200 mL + 精製水 (dH2O) 700 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)​ (#9997):1X TBST を1 L調製する場合、10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  7. Nonfat Dry Milk (脱脂粉乳) (#9999)
  8. ブロッキングバッファー:5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST;150 mlLを調製する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  9. 洗浄バッファー:1X TBST;10xTBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください (上記6をご参照ください)。
  10. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー:5% BSA含有1X TBST;20 mLを調製する場合は、BSA 1.0 gを1X TBST 20 mLに加えてよく混ぜ合わせ、完全に溶解してください。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack (#7727)
  13. ​Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa) (#13953)
  14. 転写膜 (#12369):このプロトコールはニトロセルロース膜を用いて最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  15. HRP標識二次抗体:Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074)
  16. 検出試薬:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意:転写確認用のPrestained Protein Marker (#13953、5 µl/lane) および分子量確認用のBiotinylated Protein Ladder (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意:10 cm x 10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション:転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗ってください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体液10 mL (製品のデータシートに記載されている希釈バッファー、希釈率をもとに適切に調製してください) 中で転写膜を静かに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、1:2000希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1:1000–1:3000希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法:

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新:2005年6月

改訂日:2013年11月

ウェスタンブロットリプロービングプロトコール

既存の膜のリプロービングは、サンプル量が限られている場合、複数のタンパク質を独立してイムノブロットする便利な手法です。最高の結果を得るためには、リプロービングは避け、常に新しくブロッティングを行うことを推奨します。リプロービングは価値ある方法ですが、ブロットをリプロービングするごとに、バックグランドシグナルが増す可能性があります。また、リプロービング前にまず抗体複合体が除去されていることを確認し、新しい抗体の結合によるシグナルが、最初の免疫沈降実験の残りのシグナルではないことを確認してください。これは、このブロットをECL試薬で再露光し、次の一次抗体を追加する前にシグナルがないことを確かめることで、確認できます。

A. 溶液および試薬

注意:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水または同等の精製水で調製してください。

  1. ​洗浄バッファー:​Tris Buffered Saline with Tween® 20; 10X TBST (#9997) を精製水で10倍希釈してください。
  2. ストリッピングバッファー:100 mLを調製する場合は、1M Tris-HCl (pH 6.8​) 6.25 mL、20% SDS 10 mL、βメルカプトエタノール700 μLを混ぜ合わせてください。精製水 (dH20) で100 mLにしてください。使用直前に新しいバッファーを調製してください。

B. プロトコール

  1. フィルム露光後、転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。最良の結果を得るために、転写膜は乾かさないようにしてください。
  2. 転写膜をストリッピングバッファー中で緩やかに振盪しながら、50°Cで30分間インキュベートしてください。
  3. 転写膜をTBSTで各5分間、6回洗ってください。
  4. オプション:最初のシグナルを確実に除去するために、転写膜をTBST 10 mLで5分間、2回洗ってください。転写膜をLumiGLO®で穏やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。転写膜の過剰な液を除去してください。乾かさないでください。ラップで包んで、X線フィルムに露光してください。
  5. 再度転写膜をTBSTで各5分間、4回洗ってください。
  6. 転写膜の再利用の準備が整いました。ウェスタンブロッティングプロトコールの「I. 転写膜のブロッキング」と「II.抗体のインキュベーション」の手順に従って、検出を開始してください。

更新:2005年6月

改訂日:2016年10月

Protocol Id: 10

未変性タンパク質の免疫沈降

このプロトコールには、Protein A磁気分離による未変性タンパク質の免疫沈降の手順が記載されています。この手順で得られたサンプルは、ウェスタンブロッティングやキナーゼ活性による解析にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS) ​(#9808):1X PBSを1 Lを調製する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Cell Lysis Buffer (#9803):1X Cell Lysis Bufferを10 mL調製する場合は、10X Cell Lysis Buffer 1 mLを精製水 (dH2O) 9 mlに加え、混ぜ合わせてください。

    注意:使用直前に1 mM PMSF (#8553) を加えてください

  3. 3X SDS Sample Buffer (Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)):3X SDSローディングバッファーに1/10​量の30X DTTを加え、新しい3X 還元用ローディングバッファーを調製してください。
  4. Protein A Magnetic Beads (#73778)
  5. Magnetic Separation Rack (#7017または#14654)
  6. 10X Kinase Buffer (キナーゼアッセイ用) (#9802):1X Kinase Bufferを1 mL調製する場合は、10X Kinase Buffer 100 µLを精製水 (dH2O) 900 µLに加えて、混ぜ合わせてください。
  7. ATP (10 mM) (キナーゼアッセイ用) (#9804):ATP (200 µM) を0.5 mL調製する場合は、ATP (10 mM) 10 µLを1X Kinase Buffer 490µLに加えてください。

B. 細胞ライセートの調製

  1. 培地を吸引してください。目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 未変性状態で細胞を採取するために、培地を除去し、氷冷した1X PBSで細胞を1回洗ってください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1X Cell Lysis Buffer 0.5 mLを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞を掻き取り、遠心分離用チューブに移してください。氷上に保持してください。
  5. 氷上で超音波処理を3回 (各5秒間) 行なってください。
  6. 4°C、14,000​ x gで10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞ライセートです。必要に応じて、ライセートは-80°Cで保存することができます。

C. 免疫沈降

細胞ライセートのプレクリア (オプション)

Protein A Magnetic Beadsへのタンパク質の非特異的結合を低減させるために、細胞ライセートのプレクリアステップを強くお勧めします。テストサンプルとアイソタイプコントロールを用意するのに十分な量のライセートをプレクリア処理してください。

  1. 磁気ビーズのストックチューブを手早くボルテックスし、再懸濁してください。

    重要:使用直前に Magnetic Beads #73778を前洗浄してください (ステップ2)

  2. ビーズスラリー20 μLを新しいチューブに移してください。チューブを磁気分離ラックに10-15 秒間設置してください。

    溶液が澄んだらバッファーを注意深く除去してください。1X Cell Lysis Buffer 500 μLを磁気ビーズペレットに加え、手早くボルテックスしてビーズを洗ってください。チューブを磁気分離ラックに戻してください。溶液が澄んだらバッファーを除去してください。もう一度、洗いの操作を繰り返してください。

  3. 細胞ライセート200 μLを前洗浄した磁気ビーズ20 μLに加えてください。

    重要:ライセートの至適濃度は、標的タンパク質の発現レベルによって異なります。開始濃度として、250 μg/mL-1.0 mg/mLをお勧めします。

  4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
  5. 磁気分離ラックを使用して、ビーズをライセートから分離し、プレクリアされたライセートを新しいチューブに移して、磁気ビーズペレットを捨ててください。
  6. 免疫沈降セクションへと進んでください。

免疫沈降

重要:免疫沈降での一次抗体の特異的な結合を確認するために、適切なアイソタイプコントロールの使用を強くお勧めします。ラビットポリクローナル一次抗体にはNormal Rabbit IgG #2729、ラビットモノクローナル一次抗体にはRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900、マウスモノクローナル一次抗体にはMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415を使用してください。同一濃度のアイソタイプコントロールを用い、また、一次抗体のサンプルと並行してプロトコールを進める必要があります。

  1. 製品データシートに記載されている推奨希釈率に従い、一次抗体を、細胞ライセート 200 µLに加えてください。ローテーターを用いて、4°Cで一晩インキュベートし、免疫複合体を形成させてください。
  2. 予め磁気ビーズを前洗浄してください (細胞ライセートのプレクリアセクション、ステップ1と2を参照してください)。
  3. ライセートと抗体 (免疫複合体) を含む溶液を、前洗浄した磁気ビーズぺレットを入れたチューブに移してください。
  4. ローテーターを用いて、室温で20分間インキュベートしてください。
  5. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。ペレットを1X Cell Lysis Buffer 500 µLで5回洗ってください。洗いの操作は氷上で行ってください。
  6. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼ活性分析 (セクション D) で解析してください。

D. サンプルの解析

以下のステップから適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングで解析する場合

  1. ペレットを3X SDSサンプルバッファー20-40 μLで再懸濁し、手早くボルテックスして混ぜ合わせ、手早く遠心分離してサンプルを沈殿させてください。
  2. サンプルを95-100°Cで5分間加熱してください。
  3. 磁気分離ラックを使用してビーズを分離してください。上清を新しいチューブに移してください。上清がサンプルです。
  4. サンプルをウェスタンブロット解析してください (ウェスタンブロッティングプロトコールをご覧ください)。

注意:免疫沈降に用いた一次抗体がウェスタンブロットで検出されることがあります。変性IgG重鎖 (およそ50 kDa) によって起こるマスキングを最小化するには、Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) またはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。変性IgG軽鎖 (およそ25 kDa) によって起こるマスキングを最小化する場合は、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (またはHRP conjugate #5127) の使用を推奨します。

キナーゼアッセイで解析する場合

  1. ペレットを1X Kinase Buffer 500 µLで2回洗ってください。氷上に保持してください。
  2. 200 µM ATPと適切な基質を添加した1X Kinase Buffer 40 µLでペレットを懸濁してください。
  3. 30°Cで30分間インキュベートしてください。
  4. 3X SDSサンプルバッファー20 µLで反応を停止させます。ボルテックスした後、30秒間遠心分離してください。
  5. リン酸化基質を含む上清を、新しいチューブに移して下さい。
  6. サンプルを95-100°Cで2-5分間加熱し、14,000 x gで1分間遠心分離してください。
  7. サンプル (15-30 µL) をSDS-PAGEゲルにロードしてください。

更新:2008年12月

改訂日:2018年4月

Protocol Id: 410

免疫蛍光染色 (免疫細胞染色)

A. 溶液および試薬

効率的でお得な調製済み試薬が入った#12727 Immunofluorescence Application Solutions Kitを使用して、質の高い免疫蛍光染色画像データを取得しましょう。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phosphate Buffered Saline (PBS):(#9808) 1X PBS 1 Lを用意する場合は、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。pHを8.0に調整してください。
  2. ホルムアルデヒド:16%、メタノール不含、Polysciences, Inc. (cat# 18814)、新しいものを使用し、開封した瓶は暗所で4℃で保存してください。使用する際は1X PBSで希釈してください。
  3. ブロッキングバッファー​ (1X PBS/5%正常血清/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、二次抗体の免疫動物と同じ動物種の正常血清0.5 mL (例:Normal Goat Serum (#5425)) と20X PBS 0.5 mLを精製水 (dH2O) 9.0 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 µLを加えてください。
  4. 抗体希釈バッファー ​(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):10 mLを用意する場合は、Triton™ X-100 30 μLを1X PBS 10 mLに加えてください。混ぜ合わせた後、BSA (9998​) 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  5. 推奨される蛍光標識抗ウサギ二次抗体:

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)、Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)

B. 試料作製 - 培養細胞株 (IF-IC)

注意:マルチウェルプレート、チャンバースライドあるいはカバーガラス上で直接細胞を培養、薬剤処理、固定および染色してください。

  1. 溶液を吸引除去し、細胞が2 - 3 mm浸る程の4%ホルムアルデヒド (1X PBSで希釈) を加えてください。

    注意:ホルムアルデヒドは毒性があるので、ドラフトチャンバー内でのみ使用してください。

  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 免疫染色操作に進んでください (セクションC)。

C. 免疫染色

注意:特に指定がなければこれ以降のインキュベーションは室温で行い、乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱や蓋付きのディッシュ/プレートを使用してください。

  1. ブロッキングバッファーでサンプルを60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、データシートの記載に従って一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体を加えてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え、サンプルを暗所、室温で1 - 2時間インキュベートしてください。
  7. 1X PBSで各5分間、3回すすいでください。
  8. 切片をProlong® Gold Antifade Reagent (#9071)、あるいはProlong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) とカバーガラスで覆ってください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4°C、暗所で、水平にして保存してください。

更新:2006年11月

改訂日:2013年11月

Protocol Id: 24

フローサイトメトリー (メタノールによる透過化プロトコール、ラビット抗体)

A. 溶液および試薬

本プロトコールに必要なすべての試薬は、Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593でまとめてセットとしてご購入いただけます。下に記載されているカタログ番号から個別にご購入いただくこともできます。

注意​:溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS):1X PBSを1L調製する場合は、10X PBS (#12528) 100 mLを精製水900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 4%ホルムアルデヒド、メタノール不含 (#47746)
  3. 100% Methanol (#13604):使用前に氷冷してください
  4. 抗体希釈バッファー:調製済みのFlow Cytometry Antibody Dilution Buffer (#13616) を購入いただくか、ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998) 0.5 gを100 mLの1X PBSに溶解して0.5%のBSA PBSバッファーを調製してください。4℃で保存してください。
  5. 推奨される抗ウサギ二次抗体:​:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

注意:実験に蛍光細胞染色色素 (生死判別色素、DNA色素など) を使用する場合は、色素の製品ページの推奨プロトコールを参照してください。フローサイトメトリーでの使用が検証済みの細胞染色色素の一覧はwww.cellsignal.com/flowdyesをご覧ください。

B. 固定

注意:接着細胞や組織は固定操作の前に十分に解離させ、単一細胞の懸濁液にする必要があります。

注意:遠心分離の最適条件は細胞のタイプと試薬の容量によって異なります。一般的には、150-300 gで1-5分間で細胞を十分にペレット化することができます。

注意​:全血を用いる場合は、固定の前に赤血球を溶解し、遠心分離により洗ってください。

注意:CDマーカーやその他細胞外タンパク質を標的とする抗体について、エピトープがホルムアルデヒドやメタノールで破壊される場合は、抗体反応を固定操作の前に行うことがあります。この場合、抗体が標的に結合したままの状態で固定と透過化プロセスを行います。ただし、一部の蛍光色素 (PEやAPC) はメタノールで損傷を受けますので、透過化の前に加えないでください。初めて行う実験については、スモールスケールで予備実験を行うことをお勧めします。

  1. 遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去してください。
  2. 100万細胞当たり100 µLの4%ホルムアルデヒドを加え、再懸濁してください。個々の細胞どうしがクロスリンクされないように、ペレットをよくほぐしてください。
  3. 室温 (20-25℃) で15分間固定してください。
  4. 1X PBSをさらに加えて遠心分離し、細胞を洗ってください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。細胞を1X PBS 0.5-1 mLで再懸濁してください。透過化の手順に進んでください。
    1. または、1X PBSに懸濁した細胞を4°Cで一晩保存することもできます。

C. 透過化処理

  1. 予め冷やした細胞へ、穏やかにボルテックスしながら終濃度が90%になるように氷冷した100%メタノールをゆっくりと加えてください。
  2. 氷上に最低10分間静置し、透過化してください。
  3. 免疫染色 (セクションD) を進めるか、細胞を90%メタノール中で-20°Cで保存してください。

D. 免疫染色

注意​:血球計算盤または代替の方法により細胞数を測定してください。

  1. 必要な細胞数をチューブかウェルに分注してください。(通常、アッセイごとに5x105-1x106細胞が必要です。)
  2. 過剰量の1X PBSで細胞を洗浄し、メタノールを除いてください。上清は適切な廃棄容器に捨ててください。必要に応じて洗浄を繰り返してください。
  3. 細胞を一次抗体反応液100 µLに再懸濁してください。(一次抗体反応液は抗体原液を抗体希釈バッファーで希釈して調製してください。希釈率は製品データシートの推奨希釈率に従うか、タイトレーションを行って決定してください。)
  4. 室温で1時間インキュベートしてください。
  5. 抗体希釈バッファーまたは1X PBS中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  6. 細胞を二次抗体反応液100 µLに再懸濁してください。(二次抗体反応液は、適切な蛍光色素で標識した二次抗体原液を抗体希釈バッファーで希釈して調製してください。希釈率は製品データシートの推奨希釈率に従ってください。)
  7. 室温で30分間インキュベートしてください。遮光してください。
  8. 抗体希釈バッファーまたは1X PBS中で遠心分離して洗浄してください。上清を捨ててください。洗浄操作をもう一度繰り返してください。
  9. 細胞を1X PBS 200-500 µLに再懸濁し、フローサイトメーターで解析してください。

更新:2009年7月

改訂日:2019年8月

Protocol Id: 404

特異性 / 感度

Akt Antibody detects endogenous levels of total Akt1, Akt2 and Akt3 proteins. The antibody does not cross-react with related kinases.

Species Reactivity:

ヒト, マウス, Rat, Hamster, Monkey, Chicken, D. melanogaster, Bovine, Dog, Pig, Guinea Pig

Species predicted to react based on 100% sequence homology:

Dog

使用抗原 / 精製方法

Polyclonal antibodies are produced by immunizing animals with a synthetic peptide corresponding to the carboxy-terminal sequence of mouse Akt. Antibodies are purified by protein A and peptide affinity chromatography.

バックグラウンド

Akt, also referred to as PKB or Rac, plays a critical role in controlling survival and apoptosis (1-3). This protein kinase is activated by insulin and various growth and survival factors to function in a wortmannin-sensitive pathway involving PI3 kinase (2,3). Akt is activated by phospholipid binding and activation loop phosphorylation at Thr308 by PDK1 (4) and by phosphorylation within the carboxy terminus at Ser473. The previously elusive PDK2 responsible for phosphorylation of Akt at Ser473 has been identified as mammalian target of rapamycin (mTOR) in a rapamycin-insensitive complex with rictor and Sin1 (5,6). Akt promotes cell survival by inhibiting apoptosis through phosphorylation and inactivation of several targets, including Bad (7), forkhead transcription factors (8), c-Raf (9), and caspase-9. PTEN phosphatase is a major negative regulator of the PI3 kinase/Akt signaling pathway (10). LY294002 is a specific PI3 kinase inhibitor (11). Another essential Akt function is the regulation of glycogen synthesis through phosphorylation and inactivation of GSK-3α and β (12,13). Akt may also play a role in insulin stimulation of glucose transport (12). In addition to its role in survival and glycogen synthesis, Akt is involved in cell cycle regulation by preventing GSK-3β-mediated phosphorylation and degradation of cyclin D1 (14) and by negatively regulating the cyclin dependent kinase inhibitors p27 Kip1 (15) and p21 Waf1/Cip1 (16). Akt also plays a critical role in cell growth by directly phosphorylating mTOR in a rapamycin-sensitive complex containing raptor (17). More importantly, Akt phosphorylates and inactivates tuberin (TSC2), an inhibitor of mTOR within the mTOR-raptor complex (18,19).

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Pathways & Proteins

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