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ウェスタンブロッティングプロトコール

ウェスタンブロットでは、転写膜と希釈した一次抗体を静かに振盪しながら、4℃で一晩反応させてください。一次抗体の希釈液として、5% (w/v) BSAおよび0.1% Tween®20​を含む1X TBSを使用してください。

注意：Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.

A. 溶液および試薬

サンプル調製から検出まで、ウェスタンブロットに必要な試薬が便利な一つのキットになりました：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：溶液は、逆浸透脱イオン (RODI) 水、または同等の精製水で調製してください。

  1. 20X Phospate Buffered Saline (PBS)： (#9808)：1X PBS 1 Lを調製する場合、20X PBS 50 mLを精製水 (dH2O) 950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： (#12498) 1X TBS 1 L の調製：10X TBS 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  3. 1X SDS Sample Buffer： Blue Loading Pack (#7722) またはRed Loading Pack (#7723)。1/10容量の30X DTTを3X SDSローディングバッファーに加え、還元作用を持つ新しい3X ローディングバッファーを調製してください。精製水 (dH2O) で1X に希釈してください。
  4. 10X トリス-グリシンSDS泳動バッファー：(#4050) 1X 泳動バッファー1 Lの調製：10X 泳動バッファー100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  5. 10X トリス-グリシン転写バッファー：(#12539) 1X 転写バッファー 1 Lの調製：10X 転写バッファー100 mLとメタノール200 mLを精製水 (dH2O) 700 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. 10X Tris Buffer Saline with Tween®​​ 20 (TBST)：(#9997) 1X TBST 1 Lの調製：10X TBST 100 mLを精製水 (dH2O) 900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  7. 脱脂粉乳: (#9999)
  8. ブロッキングバッファー：5% w/v 脱脂粉乳含有1X TBST：150 mLを用意する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1X TBST 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  9. 洗浄バッファー：(#9997) 1X TBST
  10. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  11. 一次抗体希釈バッファー： 1X TBST with 5% BSA; for 20 ml, add 1.0 g BSA to 20 ml 1X TBST and mix well.
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack： (#7727)
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)
  14. 転写膜​とろ紙：(#12369) このプロトコールはニトロセルロース膜に最適化されています。ポアサイズは0.2 µmをお勧めしています。
  15. HRP標識二次抗体：Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074).
  16. 検出試薬：SignalFire™ ECL Reagent (#6883).

B. タンパク質のブロッティング

最も汎用的なサンプル調製プロトコール

  1. 目的に応じて調節因子を含む新鮮な培地を加え、細胞を必要時間処理してください。
  2. 培養ディッシュから培地を吸引除去し、細胞を1X PBSで洗った後、再度吸引除去してください。
  3. 1X SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートは100 µL/ウェル、直径10 cmプレートは500 µL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞を掻き取り、抽出物を遠心分離チューブに移してください。氷上に保持してください。
  4. 10-15秒間超音波処理してください。この処理には、細胞を完全に溶解する目的と、DNAを剪断してサンプルの粘性を下げる目的があります。
  5. サンプル20 µLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷上で冷却してください。
  6. 5分間遠心分離してください。

  7. SDS-PAGEゲル (10 cm × 10 cm) に20 µLをアプライし、電気泳動してください。

    注意：電気泳動確認用のプレステイン分子量マーカー (#59329、10 µL/lane) および分子量測定用のビオチン化プロテインラダー (#7727、10 µL/lane) も同時に電気泳動することをお勧めしています。

  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意：10 cm × 10 cm (100 cm2) の転写膜用の必要量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜量を調節してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション：転写後、転写膜を室温で5分間、TBS 25 mLで洗浄してください。
  2. 転写膜を室温で1時間、ブロッキングバッファー25 mL中でインキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。

II. 一次抗体反応

  1. Incubate membrane and primary antibody (at the appropriate dilution and diluent as recommended in the product webpage) in 10 ml primary antibody dilution buffer with gentle agitation overnight at 4°C.
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  3. ビオチン化プロテインマーカーを検出するため、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074、1:2000希釈) およびAnti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075、1:1000–1:3000希釈) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を静かに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗ってください。
  5. 検出操作へ進んでください (セクションD)。

D. タンパク質の検出

使用法：

  1. 転写膜に結合したHRP (抗体標識) を、TBSTで5分間、3回洗ってください。
  2. 2X Reagent Aと2X Reagent Bを等量ずつ混ぜ合わせ、1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883) を調製してください。例えば、10 mLを調製する場合は、Reagent A 5 mLをReagent B 5 mLに加えてください。よく混ぜ合わせてください。
  3. 基質を転写膜を1分間インキュベートし、過剰な溶液を取り除き (転写膜を乾燥させないようにご注意ください) 、ラップで覆ってX線フィルムで露光してください。

* 肌に対して繰り返し露光することは避けてください。

更新：2005年6月

改訂日：2020年6月