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抗体検証における戦略:相補的戦略

抗体の検証においては、研究している抗原性の標的および使用しているアプリケーションに応じて相補的戦略を採用することをお勧めします。このアプローチからは、抗体の特異性や機能性に関する重要な情報を得ることができ、標的の生物学的な性質だけでなく下流のアッセイの厳密な要件に合わせて、注意深く調整することが可能です。

相補的戦略には、翻訳後修飾 (PTM) に対する抗体の特異性を決定するペプチドアレイやELISAの使用、特定の抗原への抗体の結合を防ぐ様々なペプチドブロッキング法があります。プロトコールの最適化は、抗体をアゴニストとして使用する中和や、タンパク質活性化など様々な機能アッセイと同様に、相補的戦略にも含まれています。これらすべての方法は、他の検証戦略によって得られた結果を裏付ける追加のデータを提供します。

翻訳後修飾に対する特異性の決定

リン酸化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、SUMO化などの翻訳後修飾はタンパク質に変化をもたらす主な原因です。タンパク質に存在する翻訳後修飾の数とタイプは構造と機能の両方に関わる可能性があるので、これらの修飾を検出および定量するための非常に特異的な抗体が必要とされます。

主にヒストン修飾に対する抗体検証に使用されますが、他の翻訳後修飾、ペプチドアレイ、競合ELISAに対する抗体も、翻訳後修飾の特異性を決定し、近位の修飾が抗体の特異性と感度に及ぼす影響を評価するのに役立つツールです。複数の翻訳後修飾を同時に評価する機能を持つことで、これらのシステムからは大量の価値あるマルチプレックスデータが迅速に得られます。

  • ペプチドアレイ

    修飾および非修飾のヒストンテールのペプチドアレイを用いて抗体の特異性を検証することができます。図1は、このようなアレイによって、選択したペプチドおよび修飾に対してMono-Methyl-Histone H3 (Lys4) (D1A9) rabbit mAbをスクリーニングする方法を示しています。その結果、抗体がHistone H3のアセチル化リジン4を特異的に検出したことの他、例えば、セリン6でのリン酸化など近隣の修飾は抗体の特異性や機能に影響しないことが示されました。

Mono-Methyl Histone H3 (Lys4) (D1A9) は、ヒストンH3 Lys4のモノメチル化に特異性が高く、Thr6のリン酸化の影響を受けません。

図1 Mono-Methyl Histone H3 (Lys4) (D1A9) は、ヒストンH3 Lys4のモノメチル化に特異性が高く、Thr6のリン酸化の影響を受けません。

ELISA

ELISAは、図2に示すように、抗体特異性の評価にも広く使用されています。ここでは、競合ELISAを用いてN6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) rabbit mAbを検証しました。これは、m6Aオリゴヌクレオチドでプレコートしたマイクロプレートウェルにて、修飾アデノシンの濃度を差次的に増加させ抗体をインキュベートすることで実施しました。その結果、抗体のm6Aへの結合は遊離のm6Aヌクレオシドによってのみ阻害されることが示され、これは標的に対する特異性を示します

N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) の特異性を競合ELISAによって決定しました。グラフは、修飾アデノシンの濃度を差次的に増加させた時のプレコートしたm6Aオリゴヌクレオチドへの抗体の結合を示しています。ここで示すように、抗体の結合は遊離のm6Aヌクレオシドによってのみ阻害されます。

図 2 N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) の特異性を競合ELISAによって決定しました。グラフは、修飾アデノシンの濃度を差次的に増加させた時のプレコートしたm6Aオリゴヌクレオチドへの抗体の結合を示しています。ここで示すように、抗体の結合は遊離のm6Aヌクレオシドによってのみ阻害されます。

非タンパク質性の標的に対する抗体の評価

小分子あるいは非タンパク質性の標的に対する抗体の検証においては、抗体がバイオシミラーを検出することなく、目的の部分に特異的かつ高感度に結合することを確認することが重要です。これは、オフターゲットな結合が実験結果を大幅に妨害しデータが使えなくなる可能性があるためです。これらの例では、例えばELISAを実施することによって、意図された抗原と、同様のサイズおよび形状を持つ他の化合物の両方に対する抗体の反応性を比較するのがよいでしょう。

ドットブロット

ELISAより簡単なアプローチは、メンブレンにブロットされたサンプルに対して検証されている抗体をスクリーニングするドットブロット技術を使用することです。この方法は、図3に示すように、翻訳後修飾の抗体特異性を評価する相補的戦略としてよく使用されます。ただし、ドットブロットは抗体特異性を試験する迅速かつ簡単な方法ではありますが、データを適切なものとするには、実験デザインを常に慎重に検討し適切に制御する必要のあることに注意してください。

図3は、多様なMyc/DDKでタグ付けされたMAGEアイソフォームを発現する構造物でのトランスフェクションの後、293T細胞から調製したライセートを用いた、MAGE-A3抗体のウェスタンブロッティング解析を示しています。MAGE-A3は、多様な腫瘍細胞に発現することの多い核タンパク質で、293Tにより内在的に発現されることはありません。このデータはMAGE-A3に対する抗体特異性を示しており、DYKDDDK抗体を使いトランスフェクションが成功しており、ローディングコントロールとして使用したβ-Actin Antibodyが示されています。

この検証実験では、先に述べたのと同じN6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) rabbit mAbを、N6-メチルアデノシンの産生を誘導するタンパク質であるMETTL3の発現の有無において293T細胞から得たRNAに対して試験しました。標的への抗体の結合はMETTL3の濃度によって明らかに影響を受けており、標的に対する特異性に確信が得られます。

モック (-) あるいは全長のヒトMETTL3 (hMETTL3; +) を発現するコンストラクトをトランスフェクションした293T細胞の抽出物から精製した総RNAを、ナイロンメンブレンにブロットしてUVでクロスリンクし、N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) で検出しました。下のパネルはメチレンブルーで染色されたメンブレンを示しますが、上のパネルは、抗体はMETTL3を過剰発現した細胞でより多くのメチル化アデノシンを検出することを示しています。

図 3 モック (-) あるいは全長のヒトMETTL3 (hMETTL3; +) を発現するコンストラクトをトランスフェクションした293T細胞の抽出物から精製した総RNAを、ナイロンメンブレンにブロットしてUVでクロスリンクし、N6-Methyladenosine (m6A) (D9D9W) で検出しました。下のパネルはメチレンブルーで染色されたメンブレンを示しますが、上のパネルは、抗体はMETTL3を過剰発現した細胞でより多くのメチル化アデノシンを検出することを示しています。

ペプチド競合

ペプチド競合アッセイにおいて、検証される抗体は下流のアプリケーションで使用される前に免疫ペプチドとインキュベートされます。理論的には、ペプチドに結合する抗体は抗原性の標的の検出を妨げます。ただし、ペプチド抗原は、抗体が結合するすべてのタンパク質への抗体の結合を阻害するため、ペプチド競合を単独で検証とすべきではありません。他の検証戦略を、ペプチド競合アッセイと組み合わせて使用することが不可欠です。

それでも、修飾ペプチドと非修飾ペプチドを直接比較できるため、ペプチド競合は翻訳後修飾に対する抗体検証に有用です。図4は、このアプローチを使用した免疫組織化学染色によるTri-Methyl-Histone H3 (Ly36) (D5A7) rabbit mAbの評価を示しています。抗体を非修飾ペプチド (左) あるいはトリメチルブロッキングペプチド (右) とインキュベートした後、卵巣がん切片を免疫組織化学染色で解析しました。その結果、抗体の染色はメチル化修飾に特異的であることを裏付ける証拠が得られました。

全体を通して、ある検証戦略が他の検証戦略よりも優れていることはなく、ここで説明するどのアプローチも単独で使用するべきではないことを強調してきました。抗体に基づくアプリケーションそれぞれからは独自の条件のセットが生じ、抗体の特異性、感度、および機能について大きく異なる課題が提示されます。一例として、ウェスタンブロッティングにおいて絶妙な特異性を示す抗体は、免疫組織化学染色アッセイでは非特異的であったり機能アッセイでは効果がなかったりすることがあります。このことから、意図したモデル系において目的のアプリケーションと一致する戦略およびプロトコールを用いて、すべての抗体を検証することが重要です。

CSTでは、ここに記載された戦略を採用して抗体試薬の信頼性を保証し、抗体が適切に機能することを研究者が期待できるアプリケーションを示しています。最終的に、目的のアプリケーション、プロトコール、モデル系で抗体が確実に機能するかどうかは、製品のエンドユーザー次第です。時間をかけて各々の実験システムを個別に最適化することは、研究を加速する正確な結果を生み出すのに重要です。

パラフィン包埋したヒト卵巣漿液性乳頭がんを、非メチル化ペプチド (左) あるいはK36トリメチル化ペプチド (右) の存在下でTri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) を用いて免疫組織化学染色で解析しました。

図 4 パラフィン包埋したヒト卵巣漿液性乳頭がんを、非メチル化ペプチド (左) あるいはK36トリメチル化ペプチド (右) の存在下でTri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) を用いて免疫組織化学染色で解析しました。

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